基于网络药理学的宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的作用机制研究

邱嘉菡 袁 烁 张家旗 邝梓君

1.广州中医药大学第一附属医院妇科，广东广州 510405；2.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405

异位妊娠是育龄期妇女的噩梦，近年来，随着盆腔炎性疾病、人工流产、辅助生育技术等高危因素的增加，其发病率逐年增长。在异位妊娠中，输卵管妊娠占比最多，约占95%，典型的临床表现为停经、下腹疼痛及阴道流血。

随着医学的进步和妇女健康意识的加强，使输卵管妊娠在早期得到诊断已成为可能。目前西医对输卵管妊娠的治疗有手术、药物和期待治疗3 种方式。其中甲氨蝶呤是药物治疗最常用药物。甲氨蝶呤是一种抗叶酸类肿瘤药，临床上常见的不良反应有骨髓抑制、胃肠道反应、黏膜损伤，以及肝脏毒性、肾脏毒性、心脏毒性、感染等[1]，其中有报道指出肝功能损伤发生了高达51.6%[2]，面对西医药物治疗严重的毒副作用，笔者所工作的广州中医药大学第一附属医院，经过十余年的临床研究，形成了“输卵管妊娠的中西医结合诊疗方案”，有报道指出中药治疗异位妊娠的成功率达97.6%[3]，为中医药治疗输卵管妊娠开辟了新天地。

中医理论认为输卵管妊娠的“本”是少腹血瘀证[4]。早在20 世纪60 年代山西医学院率先开启了中西医结合非手术治疗宫外孕，研制了宫外孕Ⅰ号方，宫外孕Ⅱ号方。其中宫外孕Ⅰ号方由桃仁、丹参、赤芍3 味药物组成，其中以丹参为君药，白芍、桃仁为臣药，共奏化瘀消癥、活血杀胚之功，本方药味虽然极其精简，但临床效果明确[5]。临床药理研究证实，宫外孕Ⅰ号方能促进腹腔凝血块的吸收，对实验动物的凝血时间[6]及淋巴回流均有一定影响。上述资料的来源均为20 世纪70 至80 年代的文献，研究焦点也多集中在血液流变学上。经过数十年的时间，现代医学的进步不止体现在临床，同时也体现在细胞、动物实验等科研相关的生物技术水平上。笔者所在的医院在临床上将宫外孕Ⅰ号方化裁的汤剂，应用于治疗早期异位妊娠有着“效廉验便”的优势[7]，同时能避免西药的某些副作用和手术的痛苦；而且对患者生育能力的保护又是治疗方案的另一优势。临床上也有不少对该化裁汤剂进行实验室研究[8-11]，但对其基础汤剂——宫外孕Ⅰ号方的研究在近年来却鲜少报道，本研究利用网络药理学方法探讨宫外孕Ⅰ号方通过何种成分，利用机体的哪些靶点，最终达到治疗异位妊娠的目的。

1 资料与方法

1.1 中药活性成分的筛选和靶点

将宫外孕Ⅰ号方各中药的中文名称“丹参”“桃仁”“赤芍”作为关键词输入中药系统药理学数据库和分析平台[12]（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP），在中国知网、维普、万方网站搜索近5 年（2015 年1 月至2020 年1 月）发表的文献报道查找未在TCMSP 中检索到的中药成分进行整理补充。获取所有中药成分以后，录入TCMSP 以匹配信息，将“口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18[13]”作为筛选条件。将上述活性成分输入Uniprot 网站进行规范并转换成药物有效成分的作用靶点，汇总去除重复值，得出有效基因靶点。

1.2 构建宫外孕Ⅰ号方的“活性成分-靶点”网络

宫外孕Ⅰ号方“活性成分-靶点”网络主要通过软件Cytoscape 3.8.0 来构建与分析，其中药物成分或靶点用“节点”（node）表示，成分及靶点之间关系用“边”（edge）表示。

1.3 异位妊娠相关靶点检索

将“异位妊娠”输入中国知网翻译，得出“ectopic pregnancy”的译名，以“ectopic pregnancy”作为关键词，在Genecards[14]、Disgenet[15]两个疾病基因数据库进行检索与筛选，将得到的靶点汇总并去除重复值，在中国知网、维普、万方网站搜索近5 年（2015 年1 月至2020 年1 月）发表的文献报道查找未预测到的已知治疗靶点，并将所得靶点录入Uniprot数据库对其名称进行标准化命名。

1.4 宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的靶点获取及构建靶蛋白蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）网络

1.4.1 宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的靶点获取 将“1.1”中取得的药物有效成分的作用靶点及“1.3”中取得的疾病治疗靶点汇总取交集，经过筛选查重，最终得到宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的靶点。

1.4.2 建构宫外孕I 号方治疗异位妊娠靶蛋白PPI网络 将最终筛选出来的宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的靶点导入Cytoscape 3.8.0 软件中的bisogenet 插件获取靶蛋白的相互作用关系。使用BisoGenet 数据库对筛选出的基因靶点构建相互作用关系网络，可得到宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的PPI 网络图，将所得图导入Cytoscape 3.8.0 软件，绘制出PPI 网络图。

1.5 分子对接评估结合潜力

选择蛋白和化合物网络度值各前3 名的蛋白和活性成分进行分子对接。从RSCB PDB 数据库中选取相应靶蛋白并下载其3D 结构，在TCMSP 中获取活性成分的分子结构。利用Autodock Tolls 软件对蛋白进行去水、加全氢及设置受体，对核心活性成分则进行加全氢、自动分布电荷、设置为配体，进行分子对接。分子对接过程中，受体与配体的亲和力越好，其结合能越低，一般认为，结合能≤-1.2 kcal/mol，则对接结果良好，最后用Pymol 软件对其进行可视化处理。

1.6 关键靶点富集分析

将最终得到的核心靶点导入DAVID[16]数据库，进行两种富集分析：①GO 分类富集分析，包括：生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组分（cell component，CC）。由于富集靶标越多，与治疗异位妊娠相关性越高，所呈现的P 值便会越小，本课题组在分析富集结果时，选取P ＜0.01的富集数据，由小到大进行排序，将符合上述标准GO富集分析使用微生信网站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）绘制GO 富集的BP、CC、MF 三合一柱状图。②KEGG 通路富集分析。得到通路富集结果后，选取COUNT 数目排名前20 位的KEGG 通路，使用微生信网站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）绘制气泡图，并将上述通路数据的基因名及通路名称使用Cytoscape 3.8.0 软件绘制通路关系图。

2 结果

2.1 宫外孕Ⅰ号方活性成分筛选

以检索TCMSP 并根据OB 和DL 值初步筛选得到宫外孕Ⅰ号方活性成分共243 个，丹参137 个，桃仁52 个，赤芍54 个，其中桃仁和赤芍共有成分1 个，丹参和赤芍共有成分1 个，丹参和桃仁共有成分1 个，其中Degree（DC）值排名前3 的成分是β-谷甾醇、芹菜素、二氢异丹参酮Ⅰ。在中国知网、维普、万方网站搜索近5 年相关文献未查找到未纳入的有效成分。将上述活性成分输入Uniprot 网站得出丹参有2161 个有效靶点，桃仁有470 个有效靶点，赤芍有297 个有效靶点，去除重复值，得出有效基因靶点共159 个。方中OB 值排名前5 位的有效成分见表1。

表1 宫外孕Ⅰ号方部分活性成分

2.2 宫外孕Ⅰ号方活性成分-有效靶点网络构建

宫外孕Ⅰ号方活性成分-有效靶点网络具体关系见图1。图中内部绿色节点呈矩形排列者代表有效基因靶点；外圈呈圆形排列者代表药物有效成分：内层紫色六边形代表桃仁有效成分，中层绿色六边形代表赤芍有效成分，外层两圈红色六边形代表丹参有效成分；图片最下方淡黄色六边形代表共有有效成分：A1 代表桃仁和赤芍共有有效成分，A2 代表丹参和桃仁共有有效成分，A3 代表丹参和赤芍共有有效成分；图片最上方橙色圆形代表药物名称：赤芍、丹参、桃仁。整个网络图共包含338 个节点，3087 条边。宫外孕Ⅰ号方中多个有效成分对应同一靶点，多个靶点对应同一有效成分。

图1 宫外孕Ⅰ号方有效靶点网络图（见内文第7 页）

2.3 异位妊娠相关靶点检索

在Genecards 数据库中查找出5396 个靶点，由于靶点数量较多，因此通过SCORE 的中位数进行筛选，第一次中位数为1.19，第二次中位数为2.96。经过两次取SCORE 中位数后共筛选出1360 个靶点；在Disgenet 数据库中查找到49 个靶点；在中国知网、维普、万方网站搜索近5 年相关文献未查找到未纳入的有效治疗靶点。最终将所取得的上述所有靶点汇总去除重复值，并将所得靶点录入Uniprot 数据库对其名称进行标准化命名，最终得到疾病靶点共1362 个。

2.4 宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的靶点与PPI 网络构建

2.4.1 宫外孕I 号方治疗异位妊娠的靶点 得到宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的靶点：ADRB2、AR、CHEK1、ESR1、ESR2、MAPK14、NOS2、PGR、PTGS1、PTGS2、SCN5A、F2、PPARG、F10、NOS3、CDK2、ACHE、BCL2、JUN、NR3C1、PON1、HTR2A、NR3C2、ADRB1、MAOA、PLAU、CAT、GSTM1、GSTP1、MMP2、VEGFA、IL-6、TNF、CYCS、MPO、TP53、CDK1、ADH1B、BCHE、SRC、CDK4、EGFR、HMOX1、IFNG、IL-2、INSR、MAPK1、MMP1、RB1、XDH、F7、CDK6、INS、NQO1、CTSB、IL-1B、MAPK8、MMP3、SELE、DRD2、CYP1A2、CYP3A4、EDNRA、ITGB3、VCAM1，共65 个交集靶点。见图2。

图2 宫外孕Ⅰ号方活性成分靶点与异位妊娠靶点的匹配维恩图

2.4.2 宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的PPI 网络构建该PPI 网络图（图3）共包含3 个小图，左侧图为通过原始交集靶点作出的网络图，包括4613 个节点，167258 条边，经过计算得出DC、Betweenness Centrality、Closeness Centrality 的中位数分别为48、6.74E-05、0.44，以此为条件截取出中间图；中间图包括931 个节点，41 403 条边，经过计算得出DC、Betweenness Centrality、Closeness Centrality 的中位数分别为162、0.000565、0.47，以此为条件截取出右侧图；中间图包括220 个节点，5932 条边，图中节点越大，代表DC 值越大，则代表与治疗相关性越密切。DC 值排名在前5 位的靶蛋白：NTRK1、TP53、EGFR、APP、ESR1。

图3 宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠核心靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络图

2.5 分子对接分析结果

对PPI 网络中DC 值排名前3 的蛋白和活性成分进行分子对接，结果见表1[对接结果只保留每对分子对接的最低结合能（kcal/mol）]。分子对接结果显示宫外孕Ⅰ号方核心成分与异位妊娠靶点具有较好结合活性。选择最低结合能的分子对接绘制对接模式图。见图4。

图4 分子对接结果图

2.6 宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠通路富集分析

将PPI 网络中的220 个核心靶点基因导入DAVID 数据库，进行GO 富集分析及KEGG 通路富集分析。

表2 宫外孕Ⅰ号方异位妊娠靶点与核心成分分子对接的最低结合能（kcal/mol）

2.6.1 宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的GO 富集分析GO 富集分析结果显示，220 个相关靶点基因其中有207 个核心靶点基因参与富集，共得到518 个富集结果，其中包括MF 为174 项，主要涉及蛋白结合、泛素蛋白连接酶结合、酶结合等；CC 为126 项，主要涉及细胞核液、细胞核、细胞胞质溶胶等；BP 为218 项，主要涉及病毒过程、上调RNA 聚合酶Ⅱ启动子的转录、抑制细胞凋亡等。选择P 值最小排名前20 位的富集结果见图5。

图5 宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的GO 富集分析

2.6.2 宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的KEGG 通路富集分析 KEGG 分析结果：220 个相关靶点基因，其中有181 个核心靶点基因参与111 条信号通路过程。筛选得到COUNT 数目排名前20 位的通路见图6。

图6 宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的KEGG通路富集分析（见内文第8页）

将基因数目排名前20 位相关基因及通路导入Cytoscape 3.8.0 绘制的相关基因及通路关系图，见图7。进行KEGG 富集通路分析后发现，肿瘤通路、病毒致癌作用信号通路、乙肝信号通路、PI3K-AKT 信号通路、肿瘤中微小RNA 作用信号通路、细胞周期信号通路等信号通路与宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的靶点关系密切。相关基因数最高的两条通路作图见图8～9。

图7 宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的“靶点-通路”网络图

图8 肿瘤通路的相关基因

图9 病毒致癌通路的相关基因

3 讨论

山西医学院研制宫外孕Ⅰ号方为目前中药治疗异位妊娠的最常用的方剂之一，由丹参、赤芍、桃仁3 味中药组成，药味简单，组方精妙，在临床应用多年疗效显著。

本研究基于网络药理学，探讨宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的作用机制，共收集活性成分243 个，其中丹参的活性成分最多；宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的作用靶点共65 个，提示宫外孕Ⅰ号方可以利用不同有效成分通过多个靶点蛋白治疗异位妊娠。PPI 网络图提示宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的作用机制错综复杂，核心靶点涉及的范围可以分为细胞增殖及其周期、泛素化及恶性肿瘤相关指标，GO 和KEGG 富集分析结果显示，宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠涉及不同的生物过程及不同的信号通路，如肿瘤信号通路、PI3K-Akt 信号通路、细胞周期、MAPK 信号通路、FoxO 信号通路等。

异位妊娠指的是受精卵在子宫体腔以外的部位着床发育。在正常妊娠中，受精卵必须在一个极短的“窗口期”完成定位、黏附、穿透三部曲才能继续发育。牢固的黏附是着床的先决条件，而在黏附之后，滋养层细胞便开始迅速增殖，同时发生迁移和侵蚀，分化形成合体滋养层和细胞滋养层，同时分泌人绒毛膜促性腺激素（HCG）[17]。受精卵在异位的着床点虽然不能最终发育成熟，但其早期的着床过程与正常妊娠相一致。临床上疑诊或确诊异位妊娠的时候，受精卵已经完成黏附，滋养细胞正处于快速增殖分裂，向周围组织迅速迁移侵蚀，并同时分泌HCG。综观目前药物治疗异位妊娠，大多从抑制滋养细胞的增殖，最终调控其细胞周期；控制滋养细胞的迁移及侵蚀[18]等方面着手。

根据上述机制，分析本次网络药理PPI 核心蛋白结果，发现宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠DC 值排名前30 的核心蛋白与调控细胞增殖凋亡及其周期、调节细胞迁移及侵蚀有密切关系。如①TP53 为细胞周期研究领域中的明星分子，目前有研究表明p53 的高表达可能导致滋养细胞增殖[19]；细胞实验研究表明miR-520 可能通过激活内质网应激诱导滋养细胞发生凋亡[20]。②体外细胞实验同样证实miR-137 可以影响滋养细胞的增殖活性及其迁移能力[21]。分析P 值排名前20 位的KEGG 通路可以发现宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的主要通路可以分为以下三大类：①调节滋养细胞的增殖、侵袭及凋亡：目前的实验室研究表明，通过调控PI3K-AKT 信号通路[22-23]、FoxO 信号通路[24-25]、MAPK 信号通路[26-30]，下调滋养细胞的增殖速度，抑制其迁移及侵袭、促进细胞凋亡。基于上述结论，本课题组推测对于治疗异位妊娠同样可以通过抑制上述通路的功能，达到控制滋养细胞的有丝分裂，抑制滋养细胞增殖，缩短其细胞周期，最终导致滋养细胞凋亡，从而治疗异位妊娠。②与肿瘤相关性：在本次网络药理研究中发现，KEGG 富集的结果有很多与恶性肿瘤的发生发展有关的信号通路。受精卵在着床可以分泌早孕因子，以防止免疫排斥。这种免疫行为与恶性肿瘤中的免疫逃逸[31-32]行为相类似。本课题组在回顾文献中也发现目前有不少对滋养细胞的研究也以恶性肿瘤获得性特征作为切入点[10,33-36]，因此本课题组推测日后研究宫外孕Ⅰ号方对异位妊娠的作用可以借鉴肿瘤相关通路来完成。

综上所述，宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠的主要成分可能是β-谷甾醇、芹菜素、二氢异丹参酮Ⅰ等，宫外孕Ⅰ号方治疗异位妊娠主要通过NTRK1 等蛋白通过肿瘤信号通路、PI3K-Akt 信号通路、细胞周期、MAPK 信号通路、FoxO 信号通路等影响蛋白结合、细胞核质、病毒过程等生物行为。本次网络药理实验同时发现了部分核心靶点分子及富集所得通路尚未被深入研究，同时在文献回顾中发现目前此类研究的对象集中在包括流产、子痫、妊娠期糖尿病等病理妊娠的滋养细胞或体外宫内妊娠滋养细胞株，多以基因敲除、分子检测等作为干预手段。本文通讯作者目前已经成功对输卵管妊娠的绒毛组织进行体外培养[37-38]，并使用宫外孕Ⅰ号方的加味汤剂对其进行实验研究，证实该汤剂能够阻断细胞的黏附运动，抑制细胞的侵袭，减轻滋养细胞对输卵管着床部位的过度浸润，上调其凋亡率，最终达到治疗异位妊娠的目的[9,18,39]。但目前对于复方成分中不同药物的药量及相互作用分析仍缺乏系统研究模型，此后，我们可以进一步建立研究模型以实验的方式来明确之间的区别。