贮存期板栗致病青霉菌的分离鉴定

冯丽娜 温晓蕾 杨文杰 王俊凤 张娜娜 齐慧霞

摘要：为明确引起板栗种仁腐烂的青霉菌属种类及其发病症状。以贮存期板栗种仁腐烂为研究对象，利用组织分离法从贮存期板栗发病种仁的病健交界处分离纯化病原菌，验证其致病性，完成科赫氏法则，并通过形态特征和分子生物学技术相结合的方法对病原菌进行分类鉴定。利用组织分离法获得10株青霉属真菌，分离率为25%。分类鉴定显示：6株为光孢青霉菌（Penicillium glabrum），1株为菌核青霉菌（P. sclerotiorum），2株为草酸青霉菌（P. oxalicum），1株为简青霉菌（P. simplicissimum）。其中，光孢青霉的数量最多，占分离青霉菌总数的60%。致病性鉴定表明，4种青霉菌均可以引起板栗种仁腐烂。青霉菌真菌是引起贮存期板栗种仁腐烂的原因之一，这为贮藏期板栗种仁腐烂的防腐奠定了理论基础。

关键词：板栗;青霉菌;科赫氏法则;分子生物学技术;分离鉴定

中图分类号：S436.64  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2021）18-0164-05

收稿日期：2021-02-07

基金项目：国家重点研发计划（编号：2020YFD1000702）;河北省板栗产业协同创新中心（河北省教育厅平台项目2020年经费资助）。

作者简介：冯丽娜（1982—），女，河北抚宁人，硕士，讲师，研究方向为植物病理学，E-mail：fenglina82@163.com;温晓蕾（1982—），女，河北丰润人，博士研究生，实验师，研究方向为植物病害防治，E-mail：xiaoleiwen@sina.com。

通信作者：齐慧霞，硕士，教授，主要从事植物病害流行与防治研究。E-mail：qihuix@163.com。

中国是板栗之乡，板栗的年产量居世界首位。河北省唐山市迁西县、遵化市、兴隆县、青龙县等冀东地区的板栗资源丰富，产品质量优良享誉海内外。然而，近几年板栗内腐病（别称板栗实腐病）在我国板栗主产区日益严重。由于通常情况下板栗内腐病的栗果外观（板栗壳）无明显异常，而在种仁上产生坏死性斑点，甚至腐烂霉变。因此，板栗內腐病有很强的隐蔽性，给板栗批发商和加工企业造成严重损失[1]。研究表明，胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、聚生小穴壳菌（Dothiorella gregaria）等寄生性真菌是引起板栗内腐病的重要病原菌[2-4]。此外，青霉属等腐生性真菌也可引起贮藏期板栗种仁腐烂，但由青霉属真菌引起的板栗内腐病的症状和种类还不明确[5-6]。本研究以贮存期板栗种仁腐烂为研究对象，利用组织分离法从贮存期板栗发病种仁的病健交界处分离纯化病原菌，采用科赫氏法则验证其致病性，并通过形态特征和分子生物学技术相结合的方法对病原菌进行分离鉴定。从而明确致病性青霉的种类以及病害症状，旨在为贮存期该类病害的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集及培养基配制

于2018、2019年在河北省唐山市迁西县板栗主产区采集板栗果实，存放于河北科技师范学院园艺科技学院冷库备用。本试验在河北科技师范学院农学与生物科技学院实验室完成。试验所用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、水-琼脂（WA）培养基和查氏琼脂培养基按照参考文献[7-8]的方法进行配制。

1.2 病原菌的分离与形态鉴定

在无菌条件下，选择具有典型病害症状的种仁，在病健交界处取3 mm×3 mm小方块放于PDA培养基上，恒温培养。菌落长出后，挑取疑似青霉菌的菌丝进行纯化培养、保存[9-10]。分别转接至PDA、WA培养基和查氏琼脂培养基上，观察其菌落形态。

1.3 致病性检测

按照科赫氏法则进行致病性研究：用打孔器取直径为0.5 cm的分离菌菌饼，将菌饼菌丝面接种于带伤口的健康迁西早丰板栗种仁上，每种分离菌接种30个种仁，无菌水作为对照，在28 ℃条件下保湿培养10 d，观察其致病性。

1.4 病原菌的分离鉴定

按照参考文献[11]进行病原菌形态特征观察;利用ITS1/ITS4病原菌ITS序列扩增，具体方法参考文献[7];将扩增得到的ITS序列送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，将测得的ITS序列提交GenBank，并进行BLASTn比对[12]。下载同源性高于99%的已知菌株的ITS序列，通过Mega X利用NJ法构建系统发育树[13]。通过病原菌形态特征和分子生物学技术相结合的方法对病原菌进行分离鉴定[14]。

2 结果与分析

2.1 青霉属真菌的分离情况及形态特征

利用组织分离法共分离40株致病真菌，根据菌落和显微形态初步确定10株为青霉属真菌，分离率为25%。根据形态特征可分为BLGF25、BLGF28、BLGF21和BLGF4这4种青霉属真菌。

分离菌株BLGF25在PDA培养基上30 ℃培养7 d（图1-1），菌落直径3.50 cm，质地紧密，呈同心轮纹状排列，菌落中心呈橄榄土褐色，边缘为白色，菌落背面为黄绿色。在碳源培养基中的形态学特征（图2-1）表现为，菌落在查氏琼脂培养基上 25 ℃ 条件下恒温培养8 d，菌落的直径为4.76 cm，菌落呈放射褶皱状且呈现同心轮纹状，菌丝颜色为灰白色、絮状，菌落背面为淡绿色，生长均匀，不易产生分生孢子。在WA培养基上25 ℃条件下培养6 d观察其显微形态（图3-1），其菌丝存在隔膜;分生孢子梗着生次生分生孢子小梗或者三生分生孢子小梗，其末端着生椭圆形分生孢子[（2.88～3.32 μm）×（3.25～5.05 μm）]，形状像扫帚。

分离菌株BLGF28在PDA培养基上30 ℃条件下培养7 d（图1-2），菌落直径为2.80 cm，质地紧密，菌落中心呈深青色，边缘为白色，菌落背面呈淡青色。菌落在25 ℃查氏琼脂培养基上恒温培养8 d（图2-2），菌落直径达到2.94 cm，为不规则圆形，中间有不规则脐状较薄的突起，菌丝颜色为白色、絮状，生长不均匀，不易产生分生孢子，背面淡黄色。在 WA培养基上25 ℃条件下恒温培养6 d进行显微观察（图3-2），其菌丝存在隔膜;分生孢子梗着生次生分生孢子小梗，其末端着生椭圆形分生孢子[（2.96～3.22 μm）×（3.24～3.35 μm）]，形状像扫帚。

分离菌株BLGF4在PDA培养基上30 ℃条件下培养7 d（图1-3），菌落的直径为3.80 cm，质地较疏松，呈同心轮纹状，菌落中心呈浅绿色，边缘为土灰色，背面呈灰绿色。在25 ℃条件下查氏琼脂培养基上恒温培养8 d（图2-3），菌落直径约为 3.52 cm，质地紧密，菌落中心呈青绿色，边缘为白色，菌落背面呈黄绿色，生长均匀，易产生分生孢子。在 WA培养基上25 ℃条件下恒温培养6 d进行显微观察（图3-3），其菌丝存在隔膜;分生孢子梗着生次生分生孢子小梗，其末端着生椭圆形分生孢子[（2.23～2.89 μm）×（3.02～3.38 μm）]，形状像扫帚。

分离菌株BLGF21在PDA培养基中的形态学特征（图1-4）表现为，在PDA培养基上30 ℃条件下培养7 d，菌落直径为2.90 cm，质地紧密，菌落中心呈深青色，边缘为白色，背面呈淡青色，易产生大量分子孢子。在25 ℃条件下查氏琼脂培养基上恒温培养8 d（图2-4），菌落直径为3.93 cm，菌落质地紧密，菌落中心呈深青色，边缘为白色，背面呈黄绿色。生长均匀，易产生分生孢子。在WA培养基上25 ℃条件下培养 6 d 进行显微观察（图3-4），分生孢子梗着生次生分生孢子小梗或者三生分生孢子小梗，其末端着生椭圆形分生孢子[（2.52～3.24 μm）×（3.60～3.98 μm）]，形状像扫帚。

2.2 青霉属真菌致病性

利用青霉菌BLGF25、BLGF28、BLGF4、BLGF21分别回接板栗果进行致病性鉴定，结果显示4种病原菌均可导致种仁腐烂（图4），再分离后均可以获得与接种菌形态特征一致的菌株，表明4种分离菌都对板栗果实具有致病性。

2.3 病原菌的分类鉴定

提取的4种青霉菌的基因组DNA片段大小约 650 bp（图5），4种青霉菌基因组DNA条带片段在1.5%琼脂糖凝胶上显示清晰，表明这4种青霉菌的基因组DNA具有较好的完整性和较高的纯度。

将扩增得到的ITS序列送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序，菌株BLGF25、BLGF28、BLGF4和BLGF21的ITS序列提交GenBank，基因登录号分别为MN647648、MN646966、MN641484和MN647649。Blantn比对显示：菌株BLGF25、BLGF28、BLGF4和BLGF21分别与草酸青霉菌（Penicillium oxalicum：MT446169，MT446079）、简青霉菌（P. simplicissimum： HQ607998，MK387979）、光孢青霉菌（P. glabrum：MN251036，MK910045）和菌核青霉菌（P. sclerotiorum：KY445778，FJ884128）的相似度均大于99%。

通过Mega X件利用NJ法构建系统发育树（图6），结果显示，菌株BLGF25、BLGF28、BLGF4和BLGF21分别与P. oxalicum、P. simplicissimum、P. glabrum和P. sclerotiorum归为一枝。结合形态学特征，10株青霉属致病菌中6株为P. glabrum，1株为P. sclerotiorum，2株为P. oxalicum，1株为P. simplicissimum。

3 讨论与结论

青霉菌是引起贮藏期果实腐烂常见的腐生性真菌之一，由青霉菌造成的柑橘、柠檬、佛手等柑橘类水果研究报道较多[7，11，15-16]。相关研究报道表明，指状青霉（P. digitatum）、意大利青霉（P. italicum）和柑橘酸腐菌（Geotrichumcitri aurantii）是柑橘类水果中致病性最强的真菌[17-18]。相关学者

研究了引起新疆枣果霉烂病的几种青霉菌，包括波兰青霉（P. polonicum）、短密青霉（P. brevicompactum）、变幻青霉（P. variabile）、产黄青霉（P. chrysogenum）、朱黄青霉（P. minioluteum），其中波兰青霉分离频率最高，为优势种[8]。然而，青霉属真菌引起的板栗果实腐烂的报道较少，有研究表明，在板栗贮藏期无症状和带有症状的板栗种仁上均可以长出青霉属真菌（Penicillium spp.），但并未明确致病青霉菌种类[5-6]。以上研究结果表明，不同类型的植物果实在贮藏期感染青霉菌的种类也不相同，应该有针对性地采取防控措施。本研究利用形态学与分子生物学相结合的方法对引起贮存期板栗内腐病的青霉菌进行了分类鉴定。其中，小刺青霉有6株、草酸青霉有2株、菌核青霉有1株和简青霉有1株。小刺青霉占分离青霉菌总数的60%，为优势种，研究结果为防治由青霉属引起的贮藏期板栗内腐病奠定了理论基础。

青霉属真菌利用传统的形态和生理生化特征方法进行分类鉴定存在很多不确定性，科学家们一直致力于完善适合青霉属真菌的系统和分类鉴定方法。Karim等根据青霉菌特有的帚状枝结构提出青霉分类系统，将青霉分成单轮青霉、对称二轮青霉、不对称青霉和多轮青霉4个组，这种传统的分类方法得到大多数分类学家的认可[17]。Samson等将青霉分为无性型和有性型，把少数具有有性阶段的青霉种归类到子囊菌亚门[18]。Pitt又使用 Czapek Yeast Extract Agar（ CYA）、Malt Extract Agar （MEA）和25% Glycerol Nitrate Agar（ G25N ）3种鉴定青霉的培养基和方法至今在青霉的分类上占有重要的地位[19]。随着分子生物学技术的发展，具有快速、准确、灵敏优点的分子标记技术逐渐成为青霉菌分类鉴定的主要手段。目前，将传统形态学方法和分子生物学方法结合起来进行分类鉴定已成为科学家们通用的方法。本研究利用PDA、WA和碳源培养基观察其形态特征，并结合基于ITS序列的分子生物学方法对所分离的青霉菌进行鉴定，从而确定其分类地位。本研究明确了贮藏期致病性青霉的种类以及病害症状，为今后开展板栗贮藏期病害研究提供了依据。

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