丛枝菌根真菌对镉胁迫水稻秧苗生长发育的影响

许 隽，胡 浩，曾 艳，曾 奥，贺月林，唐少军，杨 祎，雷 平

(湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009)

镉(Cd)具有高毒害性和难降解性，是水稻生长发育的非必需元素，但可以在水稻植株内富集，并通过食物链危害人畜健康[1-2]。随着环境污染的加重，大米镉超标情况日益严峻，因此减少水稻对镉的吸收与转运，进而降低稻米中镉的积累具有重要的现实意义[3-4]。

菌根是指土壤中某些真菌与植物根系形成的共生体，陆地上80%以上的植物根系可以与菌根真菌形成共生体[5]。丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)是一种主要的内生菌根真菌，因AMF菌丝能与宿主植物根细胞形成丛枝-泡囊的特殊结构而得名。AMF不但能提高宿主植物应对干旱、高温等非生物胁迫的能力[6-8]，还能够提高宿主植物对土壤中锌、铜、铁等微量元素的吸收能力[9-12]。在重金属胁迫下，AMF通过促进宿主对养分的吸收、增强根系对重金属的固定能力、提高抗氧化酶活性等途径减轻重金属对宿主植物的毒害[13]。已有研究报道，在盆栽土壤中接种AMF能使水稻株高、总生物量、根系总表面积及产量分别提高20.6%，30.0%，36.6%和45.3%，减少47%的化肥施用量[14]；并且AMF接种和化肥共施能够改善稻谷的外观品质、蒸煮食味品质，并保证稻米中铁和锌的质量分数[15]；接种AMF能够显著减轻镉胁迫对水稻生长的抑制作用，在不同镉处理条件下添加AMF能够显著增加水稻生物量[16]。摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae,FM)原名摩西球囊霉(Glomusmosseae,GM)，根内根孢囊霉(Rhizophagusirregularis,RI)原名根内球囊霉(Glomusintraradice,GI)，这2种AMF广泛分布在许多类型土壤中，对宿主植物具有广谱性，容易侵染植物根系[17]，且都具有将镉固定在水稻根系减少其向上运输的作用[18]。在高浓度镉胁迫下，添加FM和RI能够使水稻叶片丙二醛含量显著降低，超氧化物歧化酶活性和脯氨酸含量显著提高[19]。FM和RI对水稻具有较强的侵染能力，RI对水稻品种广银占、旱稻502的侵染率分别为35.83%和52.08%[20]；FM、RI对水稻品种金优64的侵染率分别为86.99%和74.13%[21]。FM、RI对8个粳稻品种、11个籼稻品种和1个野生稻品种侵染能力的研究表明，籼稻品种较粳稻品种更容易被侵染[22]。

目前关于AMF对水稻秧苗能否有效侵染以及是否具有抗逆促生作用的报道还比较少，而水稻秧苗期是营养器官形成的关键时期，秧苗质量的优劣直接影响到大田水稻植株的返青、分蘖以及产量形成[23]。为此，本试验分析了无镉胁迫和有镉胁迫下FM、RI对水稻秧苗生长发育、镉吸收及转运能力的影响，以期为运用AMF菌根技术提高镉胁迫水稻植株的生长发育与产量提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

摩西斗管囊霉和根内根孢囊霉由湖南省微生物研究院菌种保藏中心提供，以白三叶草作为宿主植物进行盆栽扩繁培养，获得含三叶草根段、根外菌丝和AMF孢子的AMF菌剂，每克孢子含量30～40个。供试水稻品种为湘早籼45号。供试土壤基本理化性质为：有机质20.8 g/kg，有效氮48.3 mg/kg，有效磷25.1 mg/kg，有效钾61.7 mg/kg，总Cd含量0.012 mg/kg，pH=6.2。由于供试土壤总Cd含量极低，本研究将其按无Cd(0 Cd)土壤对待。含镉土壤的制备：在供试土样中添加适量CdCl2·2.5H2O溶液，加水淹没土壤，避光保存2个月，经电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)检测制备土壤的总镉含量为0.986 mg/kg，符合本试验1 mg/kg镉胁迫要求。

1.2 试验方法

供试无镉土壤和1 mg/kg含镉土壤经高温高压蒸汽灭菌2 h后，各称取5.0 kg，置于上口径29 cm、下口径20.5 cm、高17.5 cm的牛筋桶中，每桶均匀混入AMF菌剂100 g，设置0 Cd+CK、0 Cd+FM、0 Cd+RI、1 mg/kg Cd+CK、1 mg/kg Cd+FM和1 mg/kg Cd+RI共6个处理，每个处理3个生物学重复，其中CK为接种等量高温高压灭菌后的FM+RI菌剂。将水稻种子浸种催芽后选长势良好的种子转移至各处理的牛筋桶，每桶播种约100粒，在温室内培养，温度控制在22～25 ℃，光照时间为14 h/d，培养30 d时进行各项指标测定。

1.3 指标的测定

1.3.1 生长指标 株高：每个处理随机取10株秧苗，测量茎基部至叶顶部的长度。

生物量：每个处理随机取20株秧苗，用双蒸水洗净后于60 ℃烘干24 h;称其总质量(g)作为生物量。

1.3.2 AMF侵染率及叶绿素和Cd含量 随机选取生长良好的秧苗洗净后用剪刀分成地上部分和根，部分根用于菌根侵染率测定，部分地上部分用于总叶绿素含量测定，剩余样品烘干用于镉含量测定。

AMF侵染率：取新鲜水稻根样，用灭菌水冲洗干净，剪成长约1 cm的根段放入10 mL试管中，加入15 g/L的KOH后90 ℃水浴1 h，双蒸水漂洗干净后加入2 g/mL的HCl酸化处理30 min，双蒸水洗净后加入0.5 g/L的台盼蓝染液处理过夜，用体积分数50%的甘油洗净后在每个处理中随机挑取40条根段，在光学显微镜下观察AMF侵染状况，采用根段侵染率加权法[24]计算侵染率。

叶绿素含量：选用植物叶绿素含量测定试剂盒(CPL-2-G，苏州科铭生物技术有限公司)进行测定，叶绿素含量(mg/g)=0.01×(20.21×A645+8.02×A663)×D÷m，其中A645和A663分别表示叶绿素a和叶绿素b在645 nm和663 nm处的吸光度，D为样品的稀释倍数，m为样品质量。

Cd含量：准确称取0.1～0.2 g(精确至0.1 mg)经风干、研磨至粒径小于0.149 mm的水稻组织样品，置于消解罐中，加入1 mL浓盐酸、4 mL浓硝酸、1 mL氢氟酸和1 mL双氧水，将消解罐放入微波消解装置，使样品温度在10 min内升高到175 ℃，保持20 min。消解后冷却至室温，使用赶酸仪于150 ℃赶酸至内容物近干，冷却后用去离子水溶解内容物，将溶液转移至50 mL容量瓶，用去离子水定容至50 mL。取上清液使用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定镉含量，并计算镉转运系数(秧苗地上部分镉含量与地下部分镉含量的比值)。

1.4 数据分析

采用SPSS 20.0软件对试验数据(平均值±标准差)进行统计与分析，采用Tukey多重比较方法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 AMF对水稻秧苗生长的影响

株高和生物量是评价水稻秧苗生长状况的重要指标。不同处理水稻秧苗的生长情况如图1所示。

图1 镉胁迫土壤接种FM或RI水稻秧苗的生长情况Fig.1 Growth of rice seedlings inoculated with FM or RI under cadmium stress soil

由图2可见，在无镉胁迫的条件下，FM和RI处理组水稻秧苗株高分别为22.8和22.6 cm，较对照组分别增加8.6%和7.6%(P<0.05)；秧苗的生物量分别为1.79和1.73 g，与对照组相比无显著差异(P>0.05)。在1 mg/kg镉胁迫土壤条件下，FM和RI处理组秧苗的株高分别为20.5和19.6 cm，较对照组分别增加26.5%和21.0%(P<0.05)；秧苗的生物量分别为1.57 和1.40 g，较对照组分别增加33.1%和18.6%(P<0.05)，并且FM处理组的生物量显著高于RI处理组(P<0.05)。结果证明，FM和RI能够减轻镉胁迫对秧苗生长的抑制作用，且FM处理效果优于RI。

图柱上标不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)，图4和图5相同Different lowercase letters indicate significant differences among treatments (P<0.05),The same for Fig.4 and Fig.5

2.2 AMF对水稻秧苗根系的侵染

根系侵染率是评价AMF与宿主之间是否存在共生关系的重要指标，侵染率越高，说明AMF与宿主的共生关系越好。本试验AMF对根段的侵染情况见图3和4。显微镜观察结果显示，接种FM(图3)和RI(图略)秧苗已经形成AMF特有的丛枝-泡囊结构。

AR.丛枝；IH.根内菌丝；V.泡囊AR.Arbuscule;IH.Internal hyphae;V.Vesicle图3 FM侵染水稻秧苗形成的丛枝-泡囊结构Fig.3 Arbuscular-vesicle structure formed byFM infecting of rice seedlings

由图4可见，在无镉胁迫条件下，FM、RI对水稻秧苗根系侵染率分别为33.4%和24.9%，在1 mg/kg镉胁迫条件下，侵染率分别降低至25.1%和20.3%。在这2种土壤条件下,FM处理组的侵染率均显著高于RI处理组(P<0.05)，而CK组中AMF对水稻秧苗的侵染率均小于2%。

图4 镉胁迫条件下FM和RI对水稻秧苗的侵染率Fig.4 Infection rate of FM or RI on rice seedlings under cadmium stress conditions

2.3 AMF对水稻秧苗光合作用的影响

光合作用是植物体内重要的代谢反应，可作为植物抗逆性的判断指标。由图5可知，在无镉胁迫条件下，FM和RI处理组水稻秧苗叶片的叶绿素含量分别为3.07和3.12 mg/g，与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。在1 mg/kg镉胁迫条件下，FM和RI处理组秧苗叶片的叶绿素含量分别为2.52和2.50 mg/g，较对照组分别增加16.1%和15.2%(P<0.05)。结果表明，FM和RI能够减轻镉胁迫对秧苗光合作用的抑制效果。

图5 镉胁迫条件下FM和RI对水稻秧苗叶绿素含量的影响Fig.5 Effect of FM or RI on chlorophyll content of seedlings under cadmium stress conditions

2.4 AMF对秧苗镉吸收与转运的影响

镉胁迫条件下FM和RI对水稻秧苗镉含量及其转运的影响结果见表1。由表1可知，在1 mg/kg镉胁迫条件下，FM和RI处理组秧苗地下部分的镉含量分别为5.61和6.03 mg/kg，较对照组分别增加186.2%和207.7%(P<0.05)；秧苗地上部分的镉含量分别为0.52和0.55 mg/kg，较对照组分别减少40.2%和36.8%(P<0.05)；秧苗的镉转运系数均为0.09，较对照组减少80.0%(P<0.05)。结果表明，FM和RI能够增强秧苗根系的镉固定能力，抑制镉从根部向地上部分的转运，从而降低地上部分的镉含量。

表1 镉胁迫条件下FM和RI对水稻秧苗镉含量及其转运的影响Table 1 Effect of FM or RI on cadmium content and transport in seedlings under cadmium stress conditions

3 讨 论

本研究显示，在无镉胁迫条件下，FM和RI处理水稻秧苗的侵染率分别为33.4%和24.9%，而在1 mg/kg镉胁迫条件下其侵染率分别为25.1%和20.3%。本试验的AMF侵染率低于文献[20-22]报道的结果，推测主要原因是本试验中AMF对水稻秧苗侵染时间较短所致，本试验接种30 d(模拟水稻实际生产中的育秧周期)即进行侵染率检测，如果延长接种时间，应该能够提高AMF的侵染率。在无镉胁迫条件下，FM和RI处理组与对照组秧苗的生物量和叶绿素含量无显著性差异，可能是因为供试土壤自身养分丰富，导致AMF对秧苗的促生效果不明显。本研究表明，在镉胁迫条件下FM和RI均能够促进水稻秧苗生长，对秧苗生物量的增效作用表现为FM>RI>CK，但是在株高、叶绿素含量以及镉转运系数等指标上FM和RI并未表现出显著差异。有报道显示，FM比RI更加能够缓解镉胁迫对水稻生长的抑制作用[18]，也有文献指出RI对水稻的促生效果优于FM[25]，这些研究结论不完全一致，其原因可能是由于各试验中的AMF接种量、土壤性质、水稻品种等差异造成的。在镉胁迫条件下，水稻秧苗的叶绿素含量显著下降，主要是因为当叶片中的镉含量达到一定程度时，叶绿体膜系统、类囊体等受到破坏，同时镉离子会使与光合作用相关的酶失活，进而降低光合作用效率，导致叶绿素含量下降[26]，而FM和RI能减轻镉胁迫对秧苗光合作用的抑制作用。本研究表明，在镉胁迫条件下FM和RI处理组秧苗根部的镉含量较对照显著增加，地上部分镉含量显著减少，镉转运系数均降低80.0%。这是因为AMF能够在宿主根部形成庞大的根外菌丝网络，菌丝体具有较大的外表面积，能够增强AMF对土壤镉的吸附能力；另外，菌丝体的细胞壁由几丁质、多糖等构成，含有丰富的羧基、羟基等负电荷基团，具有吸附土壤中镉离子的能力；菌丝体的细胞膜、细胞质、泡囊等结构能够储存镉，球囊霉素、糖蛋白等菌丝分泌物能够对镉产生螯合作用，减缓镉的移动性，从而降低镉从秧苗根部到地上部的转运能力[27]。

适度的干旱有利于AMF侵染宿主根系，而水稻育秧不需要形成完全淹水环境，所以在秧苗期更加容易形成AMF菌根苗。已侵染AMF的菌根苗转移至镉污染大田，菌根苗在移栽后是否仍然具有对镉胁迫的抗性，这将是下一步研究的内容。AMF能够调节植物对镉、锰、锌、砷、铬等多种重金属的吸收与积累，增强植物对重金属污染环境的适应性，因而在修复重金属污染土壤方面具有广阔前景[28]。目前由于AMF培养技术仍不成熟，尚未实现AMF菌剂大规模的商品化应用，随着菌剂生产技术、接种技术和配套管理技术的迅速发展，AMF菌根技术将会在土壤重金属污染修复中发挥更大作用。