五味子木脂素舒张大鼠离体气管平滑肌的功能研究

陈丽华，许智莹，林程程，孙靖辉，李 贺，陈建光，王春梅

(北华大学 a 北华大学学报编辑部，b 北华大学药学院，吉林 吉林 132013)

五味子(Schisandrachinensis(Turcz) Baill) 为木兰科植物五味子的干燥成熟果实，习称“北五味子”，是吉林省道地药材，最早收载于《神农本草经》，被列为上品[1]。五味子在传统中医学中是止咳平喘的重要药物，早在汉代，张仲景在《金匮要略》记载的方剂中，均以五味子收敛肺气而止咳，多将其加入辛温、辛热之品为主药的温肺化饮方剂之中,用于治疗寒饮咳喘，如治寒饮郁肺哮喘的射干麻黄汤、里饮挟热咳喘的厚朴麻黄汤、外寒里饮咳喘的小青龙汤、里饮射肺咳喘的苓甘五味姜辛汤等[2]。在现代中医药中，五味子用于治疗呼吸系统疾病也成为大家关注的重点。王佳然等[3]运用数据挖掘技术，对《中国方剂数据库》中有关五味子的方剂进行了系统整理，筛选出631个有关五味子的方剂，其中尤以治疗肺系病症居多，出现频率高达55.09%。夏瑜桢等[4]通过检索《中医方剂大辞典》、中国知网、万方数据库等，对古今中医药治疗哮喘药的分布规律进行了研究，发现五味子在古今用药中排名均在前10位，是古今医家治疗哮喘时共同选择的核心药物，由此可见五味子在传统和现代医学治疗哮喘中的重要地位。

然而，现代药理学有关五味子治疗肺系疾病的基础研究较少，其发挥平喘作用的物质基础及作用机制尚不清楚。为此，本研究采用离体气管环灌流试验，观察五味子木脂素6种代表性单体成分对大鼠离体气管平滑肌张力的影响，并初步探讨五味子醇甲舒张气管平滑肌的作用机制，以探究五味子发挥平喘作用的物质基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验动物 Wistar健康雄性大鼠40只，体质量250～300 g/只，购自长春亿斯实验动物技术有限责任公司，动物合格证号为SCXK(吉)2015-0005。将大鼠分笼饲养于SPF级实验室，自由饮水进食，每天更换1次垫料，适应性喂养3 d后用于试验。

1.1.2 试 剂 五味子醇甲(schisandrol A)、五味子醇乙(schisandrol B)、五味子甲素(schisandrin A)、五味子乙素(schisandrin B)、五味子丙素(schisandrin C)和五味子酯甲(schisantherin A)，均购于成都普菲德物技术有限公司，纯度≥98%；普萘洛尔(propranolol)和维拉帕米(verapamil)，购自美国Sigma公司；氯化乙酰胆碱(acetylcholine chloride，ACh)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化镁(MgCl2)、氯化钙(CaCl2)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyerhyl) piperazine-1-erhanesulfonic acid,HEPES]、葡萄糖，均购自国药集团化学试剂有限公司。生理盐溶液(physiological salt solution,PSS)[5]：NaCl 135 mmol/L、KCl 5 mmol/L、MgCl21 mmol/L、CaCl22 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L，pH=7.40。

1.1.3 仪 器 HV-4离体组织器官恒温灌流系统、BL-420F生物机能实验系统、HW-1000超级恒温水浴仪,均由成都泰盟科技有限公司生产；电子分析天平，由沈阳龙腾电子有限公司生产。

1.2 方 法

1.2.1 受试药物的配制 精密称取五味子醇甲43.3 mg、五味子醇乙41.6 mg、五味子甲素41.7 mg、五味子乙素40.0 mg、五味子丙素38.4 mg和五味子酯甲53.7 mg，分别加入DMSO配制成1 mol/L的受试药物母液,使用时用DMSO依次稀释为10-1，10-2，10-3和10-4mol/L的待测药物溶液。

1.2.2 大鼠离体气管环的预备 大鼠用质量分数25%乌拉坦(4 mL/kg)麻醉后，颈部腹面正中切开皮肤，从甲状软骨下部至气管下部分叉处剪取全部气管，放入4 ℃的营养液中，去除气管周围的脂肪及结缔组织，将气管剪成长3～5 mm的气管环，随后将气管环下端固定，上端连接到张力传感器上，并置于预先注入10 mL 37 ℃生理盐溶液的浴槽内，持续通入95% O2和5% CO2混合气体[6]。大鼠气管环的张力信号由BL-420F生物机能实验系统记录。调节气管环静息张力至1.0 g，每隔15 min更换新鲜生理盐溶液1次，稳定60 min后开始后续试验。

1.2.3 五味子木脂素对气管环静息张力的影响 为了探究五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素和五味子酯甲6种五味子木脂素单体对静息状态下的大鼠气管环张力是否有影响，将气管环标本分为6组，每组6个重复。待气管环张力稳定后，每组先后向浴槽中加入10-4～1 mol/L的供试单体溶液，每个浓度加10 μL，因浴槽中预先充入了10 mL生理盐溶液，因此各单体溶液终浓度为10-7～10-3mol/L，加药时间间隔以每次加药后气管环张力趋于稳定后再加下一个浓度；对照组(CK)加入10 μL体积分数1‰的DMSO。记录离体气管环张力变化并按下式计算抑制率。

抑制率=(给药后张力-静息张力)/静息张力×100%。

1.2.4 五味子木脂素对ACh预收缩气管环张力的影响 向浴槽中加入终浓度为10-6mol/L的ACh诱导气管平滑肌收缩，待气管环收缩幅度趋于平稳时，各试验组向预先充入10 mL生理盐溶液的浴槽中加入10-4～1 mol/L的五味子木脂素单体10 μL，则其终浓度为10-7～10-3mol/L，每组6个气管环；对照组(CK)加入10 μL体积分数1‰的DMSO。加药时间间隔以每次加药后气管环张力趋于稳定后开始加下一个浓度，记录每一次气管环张力值，按下式计算抑制率[7]。

抑制率=(ACh诱发气管环最大收缩张力-加入待测药物后的气管环张力)/(ACh诱发气管环最大收缩张力-静息状态下气管环张力)×100%。

1.2.5 普萘洛尔和维拉帕米对五味子醇甲舒张气管作用的影响 普萘洛尔和维拉帕米分别为β-肾上腺素受体阻断剂及L型Ca2+通道阻滞剂。本试验选取活性较好的气管环，用10-5mol/L普萘洛尔、10-5mol/L维拉帕米和体积分数1‰的DMSO(对照组，CK)分别孵育15 min，然后采用10-6mol/L的ACh预收缩，待气管环张力稳定后，向浴槽内依次加入浓度为10-5，2×10-5，4×10-5，6×10-5，8×10-5，10-4，2×10-4，4×10-4，6×10-4，8×10-4和10-3mol/L的五味子醇甲，加药间隔方法同1.2.3节，每组6个气管环。观察气管环张力变化情况并计算抑制率(计算方法同1.2.4节)，绘制记录五味子醇甲对大鼠气管环舒张作用的量效曲线[8]。

1.3 统计学处理

每项试验各组处理后气管环张力变化结果(抑制率)均以“平均值±标准差”表示，两组间数据比较采用SPSS 22.0软件进行学生t检验分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 6种五味子木脂素单体对离体大鼠气管环张力的抑制率

6种五味子木脂素对离体大鼠气管环张力的抑制率如表1所示。

表1 6种五味子木脂素对离体大鼠气管环张力的抑制率Table 1 Inhibition rate of 6 lignans from Schisandra chinensis on tension of isolated rat tracheal rings %

由表1可知，与DMSO对照组比较，10-7～10-3mol/L的6种五味子木脂素单体对离体大鼠气管环静息张力均无显著影响(P>0.05)，提示五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素和五味子酯甲对离体大鼠气管环均无显著的直接作用。

2.2 6种五味子木脂素对ACh诱导的离体大鼠气管环收缩的抑制率

由表2可知，与DMSO对照组相比，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素均呈剂量依赖性地抑制ACh诱导的离体大鼠气管环的收缩，最大抑制率分别为(92.12±3.28)%(P<0.001)，(78.23±10.20)%(P<0.001)，(62.95±12.93)%(P<0.001)和(46.58±4.92)%(P<0.001)，可见五味子醇甲的抑制作用最强；而五味子丙素和五味子酯甲对ACh 诱导的离体大鼠气管环的收缩功能无显著影响(P>0.05)。

表2 6种五味子木脂素对ACh诱导的离体大鼠气管环收缩的抑制率

2.3 普萘洛尔和维拉帕米在五味子醇甲舒张离体大鼠气管环中的作用

图1-A显示，与DMSO对照组比较，10-5mol/L的β-肾上腺素受体阻断剂普萘洛尔孵育气管环15 min，对不同浓度五味子醇甲舒张气管环作用无明显影响(P>0.05)；而由图1-B可知，采用10-5mol/L的L型Ca2+通道阻滞剂维拉帕米孵育气管环15 min，与DMSO对照组比较，不同浓度五味子醇甲松弛气管平滑肌的作用均明显减弱，最大抑制率降低了(26.24±8.42)%(P<0.001)。结果提示，五味子醇甲舒张气管的作用可能与阻断L型Ca2+通道、阻止细胞外Ca2+内流有关，而与β-肾上腺素受体效应无关。

与DMSO组比较， **、***分别表示在P<0.01和P<0.001水平有统计学差异Compared with DMSO group,** and *** indicate difference at P<0.01 and P<0.001,respectively.图1 普萘洛尔(A)和维拉帕米(B)在五味子醇甲舒张离体大鼠气管环中的作用Fig.1 Effects of propranolol (A) and verapamil (B) on relaxation of isolated rat tracheal ring induced by schisandrol A

3 讨 论

作为我国的传统中药，五味子是止咳平喘的核心药物之一，也是最常用的抗哮喘中药之一[9]，然而五味子及其有效成分对气管平滑肌的功能是否有影响尚不明确。本试验采用大鼠离体气管环进行试验，可以排除神经体液因素对气管平滑肌的影响，能直接观察到药物对气管平滑肌的作用[10]。将6种五味子木脂素单体成分按浓度累加方式刺激离体大鼠气管环，结果显示静息状态下的支气管平滑肌张力没有明显变化，提示五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素及五味子酯甲对大鼠离体气管平滑肌张力无直接影响。

一般状况下，气管平滑肌上分布的胆碱能神经所释放的乙酰胆碱可使平滑肌处于静息状态，保持轻微的静息张力。当细胞外的生物信号与细胞膜表面偶联的特异性受体相结合时，启动特定的信号转导通路完成信息传递，引起平滑肌的收缩或舒张[11]。气管平滑肌上分布的受体主要为β-肾上腺素能受体、M胆碱能受体和组胺受体。β2肾上腺素受体兴奋会引起支气管平滑肌舒张，M胆碱受体和组胺受体兴奋会使支气管平滑肌收缩[8,12]。为了观察药物能否舒张气管平滑肌，本试验采用M胆碱受体激动药ACh预收缩离体大鼠气管环，当其张力平稳后，以浓度累加方式分别加入6种五味子木脂素单体成分，结果显示五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素可剂量依赖性地抑制ACh 诱导的气管环收缩，即具有舒张气管平滑肌的作用，其中五味子醇甲的作用最强，而五味子酯甲和五味子丙素对ACh诱导的气管环收缩没有明显影响。

气管平滑肌有多种调节机制，主要包括免疫调节机制及Ca2+通道和钾通道调节机制3个方面[13-14]。有研究表明，与正常气道平滑肌细胞相比，哮喘气道平滑肌细胞内Ca2+浓度增加[15-17]，这说明气道平滑肌细胞内Ca2+浓度的变化是哮喘发作的重要因素之一。气道平滑肌的收缩受多种信号通路的调节，包括细胞内Ca2+释放、细胞外Ca2+内流、Ca2+致敏、Na+/Ca2+交换和BK通道[18-19]。其中，决定因素之一是细胞外Ca2+内流，其受电压依赖性L型Ca2+通道、非选择性阳离子通道和Na+/Ca2+交换的调节[20-22]。ACh能够激动气道平滑肌上的M胆碱受体，开启受体依赖型钙通道(RDC)和受体操纵型钙通道(ROC)，使Ca2+内流；还可通过细胞膜上磷酸肌醇水解，产生肌醇三磷酸(IP3)和二酯基甘油(DAG)，进而使细胞内肌浆网膜上的钙通道开放，Ca2+释放，细胞内Ca2+增多，从而引发气道平滑肌收缩[23-24]。本研究结果显示，有4种五味子木脂素单体成分可抑制ACh诱导的气道平滑肌收缩，其中五味子醇甲作用最强，为了进一步探讨五味子醇甲舒张气道平滑肌的机制，本研究采用了L型Ca2+通道阻断剂维拉帕米预孵育气管环，发现维拉帕米减弱了五味子醇甲对气管环的舒张作用，由此推测五味子醇甲的作用可能与其可抑制L型Ca2+通道从而影响细胞内Ca2+浓度有关。同时，为了探究五味子醇甲舒张气道平滑肌作用与β受体的关系，本研究还采用β-肾上腺素阻断剂普萘洛尔作为工具药观察其影响[25]，结果显示离体大鼠气管环无论在有或无普萘洛尔孵育的情况下，五味子醇甲对 ACh 预收缩气管环张力的影响无显著差异，说明其对气道平滑肌的舒张作用与β-肾上腺素受体无关。

五味子木脂素是否是五味子治疗肺系疾病的物质基础，还需在后续的研究中建立哮喘动物模型以进一步验证。

4 结 论

五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素具有舒张大鼠气道平滑肌的作用，且均呈现出剂量依赖性，其中五味子醇甲的舒张作用与阻断L型Ca2+通道有关，而与β-肾上腺素受体无关。