鸡WDR5基因真核表达载体构建及对PGCs形成相关基因表达的影响

张 晨，左其生，邹艺琛，赵娟娟，张亚妮，李碧春

(扬州大学 动物科学与技术学院，农业科技发展研究院，教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏 扬州 225009)

组蛋白甲基化作为重要的表观遗传修饰，在不改变染色质结构的条件下参与许多生物学过程，包括细胞分化、细胞增殖等[1-3]。Xu等[4]发现，组蛋白H3K4me2能促进自我更新基因的表达,以维持滋养层干细胞生长；Lee等[5]发现，H3K4me3能够促进肌肉和脂肪细胞的形成； H3K4me3还能通过在心脏特异基因启动子区的富集促进胚胎干细胞向心肌细胞分化[6]。目前，对H3K4甲基化在细胞分化中的作用研究较多，但对胚胎干细胞向生殖细胞分化过程中组蛋白甲基化的作用机制研究尚不多见，尤其是在鸟类研究上。本课题组前期研究发现，H3K4me2能促进鸡原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)的形成，色氨酸天冬氨酸重复域5(WD repeat domain 5，WDR5)可改变H3K4me2水平，但是关于WDR5在PGCs形成中的具体调控作用还不清楚。

WDR5是组蛋白甲基化修饰酶的关键蛋白之一，参与组蛋白二甲基化和三甲基化的修饰过程[7]，进而参与多种生物学过程[8-11]。 研究表明，小鼠过表达WDR5后，可激活Wnt信号通路，促进软骨细胞的分化[12]；WDR5还能维持胚胎干细胞的自我更新和重编程[8,13]。在生殖干细胞调控方面，干扰WDR5可控制爪蟾H3K4me3的水平，引起其发育缺陷[7]；在突变线虫中，WDR5可引起H3K4me2/3水平降低，最终影响生殖干细胞的正常发育[14]。目前对WDR5的研究主要集中在哺乳动物上，尽管已有不少WDR5在生殖干细胞方面的研究报道，但其对鸡PGCs形成的调控机理尚不清楚。为此，本研究对WDR5进行生物信息学解析，构建重组真核表达载体pcDNA3.1-WDR5-GST，并检测其对PGCs形成相关基因表达的影响，以期为后续探究WDR5在鸡PGCs形成中的调控机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

新鲜如皋黄鸡受精蛋，由中国农业科学院家禽研究所试验禽场提供。PGCs和pcDNA3.1(+)载体，由扬州大学动物科学与技术学院教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室保存。高糖DMEM、丙酮酸钠、胎牛血清、胰酶、鸡血清，购自Gibco公司(美国)；L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、非必需氨基酸、人干细胞因子(hSCF)，购自Sigma(美国)；青、链霉素和牛血清白蛋白，购自(北京)索莱宝科技有限公司；小鼠白血病抑制因子(mLIF)，购自Millipore(德国)；FuGENE®HD，购自Promega公司(美国)；TRNzol Universal 总 RNA 提取试剂、反转录试剂盒、定量试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；BCA试剂盒、放射免疫沉淀分析(Radio Immunoprecipitation Assay，RIPA)裂解液、超敏ECL化学发光试剂盒，购自碧云天生物技术有限公司(上海)。GST抗体，购自Abcam公司(美国)；山羊抗兔IgG抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 WDR5氨基酸序列分析 利用NCBI在线网站获得WDR5(NM_001006198.1)的核酸序列，将其导入ProtParam在线分析网站进行氨基酸序列分析，同时利用NCBI保守结构域分析在线网站对WDR5的结构域进行分析。

1.2.2 WDR5蛋白质理化性质分析 利用Uniport网站、TMHMM Server v. 2.0在线网站和SignalP在线网站，分别对WDR5的亲、疏水性及跨膜结构域和信号肽表达进行分析。

1.2.3 WDR5蛋白质三级结构和互作蛋白预测 用SWISS-MODEL对WDR5的氨基酸序列进行同源建模，对获得结果的可用性、序列一致性、蛋白保守性进行分析。利用String在线网站对WDR5的互作蛋白进行预测，分析保守的互作蛋白。

1.2.4 重组真核表达载体pcDNA3.1-WDR5-GST的构建 利用NCBI网站获得WDR5的CDS区序列，在其起始密码子和终止密码子的前面分别添加kozak结构(GCCACC)和GST蛋白的编码序列，5′端和3′端分别添加KpnⅠ和EcoR Ⅰ酶切位点，合成该序列后，利用KpnⅠ和EcoR Ⅰ双酶切3 h，回收产物。将回收产物与经同样双酶切的载体pcDNA 3.1(+)连接，构建重组真核表达载体pcDNA3.1-WDR5-GST。将连接产物转化入 DH5α感受态细胞，涂布于氨苄抗性的平板过夜培养，次日挑菌，摇菌后提取重组真核表达载体进行KpnⅠ/EcoR Ⅰ双酶切鉴定。鉴定成功后，将待测菌液送往南京擎科生物科技有限公司进行测序。

1.2.5 WDR5重组蛋白在PGCs中的表达 (1)mRNA水平的检测。将pcDNA3.1-WDR5-GST重组真核表达质粒(g)和Fugene转染试剂(L)按1∶3的体系转染PGCs细胞，同时设置空白组(未处理组)和对照组(转染pcDNA3.1(+)空载体组)。培养48 h后收集细胞。用Trizol裂解液进行裂解，提取RNA，按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA备用。利用Primer 5.0软件，针对WDR5基因CDS区设计引物，交由南京擎科生物科技有限公司合成。引物信息见表1。以β-actin为内参基因，采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒检测WDR5基因mRNA的表达，试验重复3次，采用2-ΔΔCt法分析相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Table 1 Real-time fluorescent quantitative PCR primer sequences

(2)蛋白水平的检测。采用Western blot法检测WDR5重组蛋白的表达情况。收集转染后的PGCs细胞，用RIPA裂解液进行蛋白裂解，冰上孵育40 min后，4 ℃、12 000g离心15 min，收集上清液。用BCA试剂盒测定上清液蛋白浓度后,取20 μg蛋白样品，将其用RIPA裂解液稀释至20 μL,加入4 μL 6×SDS-PAGE蛋白缓冲液后，100 ℃变性30 min。将各组蛋白用12%的SDS-PAGE进行分离，半干法将蛋白转移到硝酸纤维素膜。室温下用体积分数1%的牛血清白蛋白封闭液孵育2 h，4 ℃下将膜和特定一抗(GST抗体)孵育过夜，TBST清洗3次后，加入相应二抗(羊抗免IgG)孵育2 h，TBST洗涤3次，用ECL化学发光试剂盒进行显影。

1.2.6 WDR5蛋白过表达对PGCs形成相关基因的影响 以β-actin为内参基因，采用RT-qPCR试剂盒检测WDR5对PGCs形成相关基因(DDX4、C-KIT、BLIMP1、LIN28B和PRDM14)表达的影响。试验重复3次，采用2-ΔΔCt法分析相对表达量。利用Primer 5.0软件，针对上述各基因CDS区设计引物，交由南京擎科生物科技有限公司合成。引物信息见表1。

1.2.7 数据分析 利用SPSS统计软件建立数据库并处理数据，用单因素方差分析检验组间差异，采用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 WDR5氨基酸序列分析

分析结果显示，WDR5核酸序列可编码334个氨基酸，分子质量为36 565.41 u，理论等电点(PI)为8.54，半衰期为30 h，不稳定指数为30.81。WDR5含有1个保守结构域WD40，该结构域含有7个WD40重复序列。结果说明,WDR5蛋白质为稳定蛋白，保守结构域为WD40。

2.2 WDR5蛋白质理化性质分析

结果显示，WDR5亲水性高，不属于膜蛋白；WDR5不含跨膜结构域，无信号肽表达。结果表明，WDR5不属于跨膜蛋白，可能为核表达蛋白。

2.3 WDR5三级结构和互作蛋白分析

用SWISS-MODEL对鸡WDR5进行同源建模，结果匹配到的蛋白质描述为WDR5，与鸡的WDR5一致度为96.71%，大于30%，说明数据可用；全球性模型质量估测(Global Model Quality Estimation, GMQE)值为0.93，说明数据质量较好；匹配度QMEAN4为-0.68，接近0，说明待测蛋白与模板蛋白匹配度高。以上结果说明，鸡WDR5蛋白保守性较高。

利用String在线网站对WDR5的互作蛋白进行预测，结果表明鸡上预测到的与WDR5结合的蛋白包括DPY30、类ASH2蛋白(ASH2 Like，ASH2L)、RB结合蛋白5(RB Binding Protein 5，RBBP5)和MLL2等组蛋白甲基化酶compass组分。该结果进一步说明，WDR5的保守性较高，属于compass组分成员(图1)。

图1 鸡WDR5互作蛋白分析Fig.1 Interaction protein analysis of chicken WDR5

2.4 重组真核表达载体pcDNA3.1-WDR5-GST的鉴定

对构建的pcDNA3.1-WDR5-GST进行KpnⅠ/EcoR Ⅰ 双酶切，获得了1 677 bp的目的片段和约5 400 bp的载体片段(图2)。测序结果显示，WDR5已插入pcDNA3.1(+)载体，未发生移码和突变现象。KpnⅠ/EcoR Ⅰ 双酶切和测序结果说明，重组真核表达载体pcDNA3.1-WDR5-GST构建成功，可用于后续试验。

2.5 WDR5重组蛋白在PGCs细胞中的表达

RT-qPCR结果(图3-A)显示，转染pcDNA3.1-WDR5-GST载体后，WDR5基因的表达水平极显著高于对照组(P<0.01)。Western blot结果(图3-B)显示，重组蛋白分子质量约为62 ku(GST标签蛋白约26 ku，WDR5约36 ku)。以上结果说明，重组真核表达载体能稳定表WDR5重组蛋白。

M.DL10000 DNA Marker；1.Kpn Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切产物；2.pcDNA3.1-WDR5-GST M.DL10000 DNA Marker;1.Restriction enzyme fragments by Kpn Ⅰ/EcoR Ⅰ;2.pcDNA3.1-WDR5-GST 图2 重组真核表达载体pcDNA3.1-WDR5-GST的双酶切鉴定Fig.2 Double enzyme digestion identification of recombinant plasmid pcDNA3.1-WDR5-GST

A.基因水平检测；B.蛋白水平检测。**.表示与对照组差异极显著(P<0.01)，图4同A.The detection of gene expression;B.The detection of protein expression.**.This means that the difference between the two groups is very significant (P<0.01),the same for Fig.4

2.6 WDR5过表达对PGCs形成相关基因的影响

收集转染后的PGCs细胞进行RT-qPCR检测，结果(图4)显示，过表达WDR5后，PGCs标记基因DDX4、C-KIT、BLIMP1、LIN28B和PRDM14表达水平均极显著升高(P<0.01)，说明WDR5过表达对PGCs形成相关基因的表达具有重要的调控作用。

图4 WDR5过表达条件下PGCs相关基因表达水平的变化Fig.4 Expression of PGCs related genes after overexpression of WDR5

3 讨 论

WDR5是组蛋白甲基化复合物组分之一，具有典型的WD40核心亚基。WD40结构域通常以螺旋形式出现，包含7个区域。特异性的WD40螺旋结构有助于蛋白之间的结合[7,15]。本研究通过生物信息学分析发现，鸡WDR5蛋白具有典型的WD40结构域，该结构域含有7个WD40重复序列，说明在鸡上WDR5具有物种保守性。现有研究认为，WD40结构域参与了多种生物学过程，包括信号转导、囊泡运输、细胞骨架组装、细胞周期调控、细胞凋亡、染色质动力学和转录调控等[16-20]。含有WD40亚基的WDR5可作为组蛋白甲基化酶复合体成分，基于前期研究得出的H3K4me2参与鸡PGCs形成[21]的结果，本研究发现，WDR5基因过表达会提高PGCs相关基因的表达水平。有研究表明，在鸡上降低DDX4会减少PGCs的数量[22]；BLIMP1、PRDM14是决定生殖细胞命运的关键基因[23-24]，C-KIT和LIN28B则是PGCs生长发育必不可少的基因[25]。Robert等[26]发现，WDR5在维持秀丽隐杆线虫生殖细胞多能性方面有重要作用。据此推测，WDR5在鸡PGCs形成中可能也有重要作用，而其具体机制仍需进一步研究。

本研究发现，WDR5不含跨膜结构域，亲水性高，无信号肽表达，说明其不属于膜蛋白。研究表明，WDR5是高度保守的核蛋白，参与许多与染色质相关的生物学过程[27]，因此推测鸡WDR5可能在细胞核中表达。三级结构分析发现，鸡WDR5具有高度保守性，匹配一致度为96.71%。有研究表明，WDR5通常与ASH2L、DPY30和RBBP5组成甲基化酶复合体[28]，可激活甲基转移酶MLL家族活性。且WDR5含有特殊的“Win motif”结构，而该结构是其与MLL家族蛋白结合所必需的。以上研究说明，WDR5通常以“支架”蛋白的形式在复合体中发挥作用[29-30]。本研究发现，鸡WDR5的互作蛋白包括人们所熟知的复合体组分ASH2L、RBBP5和DPY30，复合体蛋白激活的核心蛋白可能为MLL家族的MLL2蛋白。Dias等[30]发现，果蝇中WDR5与NSL的2个亚基KANSL1和KANSL2发生相互作用，这与本研究结果(KAT8调控因子NSL复合物亚基3(KAT8 Regulatory NSL Complex Subunit 3，KANSL3)可能与WDR5结合)不同，造成这一差异的原因可能是物种不同所致，但这还需进一步验证。

基于WDR5蛋白的互作能力，探究WDR5在原始生殖细胞形成过程中的作用机制时，需要可用于Co-IP和CHIP试验的抗体。然而由于鸡种属的特殊性，目前尚无同时满足二者要求的商品化抗体。因此，本研究构建了重组pcDNA3.1-WDR5-GST真核表达载体，通过定量和Western blot验证其活性，以用于后续Co-IP和CHIP试验。

4 结 论

鸡WDR5蛋白含有典型的WD40亚基，不含跨膜结构域，也无信号肽表达，为亲水性蛋白，具有高度保守性，互作蛋白包括ASH2L、RBBP5、DPY30和KANSL3。成功构建了pcDNA3.1-WDR5-GST重组真核表达载体，并验证了其mRNA和蛋白水平的活性；过表达WDR5可提高PGCs形成相关基因的表达水平。