miR-506-3p靶向Beclin-1调控烧伤后皮肤成纤维细胞的自噬和增殖机制研究

史敏　丁欣强　郭晓波　陈炜荧　张明雨

[摘要]目的：探討烧伤后皮肤成纤维细胞中miR-506-3p表达与Beclin-1的靶向关系及增殖调控作用，为烧伤后瘢痕的治疗提供新靶点。方法：采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测烧伤组织和热损伤皮肤成纤维细胞中miR-506-3p水平;Targetscan在线预测，双荧光素酶验证miR-506-3p与Beclin-1靶向关系;qRT-PCR和Western blot检测miR-506-3p模拟物或抑制剂转染对Beclin-1表达的影响;qRT-PCR检测热刺激后miR-506-3p模拟物（10nM或30nM）转染成纤维细胞miR-506-3p的表达并采用CCK-8检测转染细胞增殖效率。结果：与正常组织相比，烧伤组织和热损伤成纤维细胞中miR-506-3p的表达下调;miR-506-3p和Beclin-1存在靶向调控作用关系，并且miR-506-3p可负调控Beclin-1表达;miR-506-3p模拟物转染以剂量依赖的方式抑制了热刺激的真皮成纤维细胞中的细胞增殖。结论：miR-506-3p通过靶向抑制Beclin-1表达来调节烧伤后皮肤成纤维细胞的自噬和增殖，有可能成为烧伤愈合后瘢痕治疗的潜在靶标。

[关键词]miR-506-3p;Beclin-1;成纤维细胞;自噬;增殖;烧伤

[中图分类号]R644    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2021）08-0095-04

miR-506-3p Targets Beclin-1 to Regulate Autophagy and Proliferation of Post-burn Skin Fibroblasts

SHI Min1，DING Xin-qiang2，GUO Xiao-bo3，CHEN Wei-ying1，ZHANG Ming-yu1

（1.Medical School of Xian Peihua University，Xian 710125，Shaanxi，China;2.Department of Dermatological，Xi'an Children's Hospital，Xian 710003，Shaanxi，China;3.Clinical Laboratory， Xi'an Central Hospital，Xian 710004，Shaanxi，China）

Abstract： Objective  To explore the targeting relationship between the expression of miR-506-3p and Beclin-1 in heat-damaged skin fibroblasts and its proliferation regulation effect on Beclin-1， in order to provide a new target for the treatment of post-burn scars. Methods  We used qRT-PCR to detect miR-506-3p of post-burn tissue and heat-damaged skin fibroblasts， used Targetscan online prediction and dual luciferase to verify the targeting relationship between miR-506-3p and Beclin-1. We used qRT-PCR and Western blot to detect the effect of miR-506-3p mimic or inhibitor transfection on Beclin-1 expression. The expression of miR-506-3p in fibroblasts transfected with miR-506-3p mimic （10nM or 30nM） after thermal stimulation was detected by qRT-PCR and the proliferation efficiency of transfected cells was detected by CCK-8. Results  Compared with normal tissues， the expression of miR-506-3p in post-burn tissues and heat-damaged fibroblasts is down-regulated. There is a targeted regulation relationship between miR-506-3p and Beclin-1， and miR-506-3p can negatively regulate the expression of Beclin-1， and miR-506-3p mimic transfection inhibits cell proliferation in heat-stimulated dermal fibroblasts in a dose-dependent manner. Conclusion  MiR-506-3p regulates the autophagy and proliferation of post-burn skin fibroblasts by targeting the expression of Beclin-1， and may be a potential target  on scar for post-burn healing.

Key words： miR-506-3p; Beclin-1; fibroblasts; autophagy; proliferation; burn

烧伤皮肤愈合后转化为纤维瘢痕组织，主要特征为成纤维细胞过度增殖及细胞外基质聚集[1]。瘢痕的形成严重影响患者身心健康，因而研究瘢痕发生机制中的基因治疗靶点具有重要意义。大量文献表明，自噬可降解异常细胞蛋白聚集体和受损细胞器的分解代谢途径，在生物体稳态维持中发挥着重要作用[2]。自噬水平异常可导致多种疾病发生，Beclin-1是至关重要的促自噬蛋白，然而很多因素可影响Beclin-1表达，其中就包括微小RNA（miRNA），如Chen等发现miR-30a通过靶向Beclin-1来调节癌细胞的自噬[3]，miR-30a通过下调Beclin-1表达来降低肝星形细胞的自噬活性[4]。本课题组前期研究也证实，热损伤成纤维细胞具有miR-506-3p表达下调和自噬水平上调（LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5表达显著上调，而p62表达下调）特征。然而，就miR-506-3p与Beclin-1是否在成纤维细胞中存在靶向关系目前尚无报道。因此，本研究旨在探讨皮肤成纤维细胞中miR-506-3p和Beclin-1的作用关系，以期为烧伤后瘢痕的治疗提供新靶点。

1  材料和方法

1.1 组织样本与细胞培养：2018年4月-2019年5月从西安市儿童医院皮肤科收集Ⅱ度或Ⅲ度烧伤患者在烧伤后24h内的样本30份，将收集的烧伤皮肤组织和邻近正常对照皮肤组织置于液氮中，并在-80℃储存行进一步实验。取材前获得患者本人或家属签署的知情同意书，所有实验操作均获得医院伦理委员会同意。患者在术前1年内未接受任何治疗，无肿瘤病史。

人皮肤成纤维细胞系HSAS4和人胚肾293T（HEK 293T）细胞由空军军医大学提供。所有细胞在37℃ 5%CO2环境下培养，DMEM含100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的抗生素混合物，并含10%胎牛血清。建立细胞热损伤模型，将HSAS4细胞培养物放入热水器槽中，在52℃下孵育30s（模拟烧伤状态），然后在正常条件下孵育。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞转染：miR-506-3p模拟物、miR-506-3p抑制剂和相应的阴性对照（NC模拟物和NC抑制剂）购自RiboBio。基因过表达载体（Ad-Beclin-1）和对照载体购自GenScript Biotech公司。真皮siRNA成纤维细胞以104个细胞/孔的密度接种到六孔板中，然后用于细胞转染。根据说明书，采用Lipofectamine 2000质粒或寡核苷酸瞬时转染细胞。

1.2.2 RNA提取和实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）分析：依Trizol试剂指导提取皮肤成纤维细胞和皮肤组织总RNA;采用PrimeScript RT试剂盒和Mir-XTM miRNA试剂盒（塔卡拉，中国大连）分别将mRNA和miRNA均反转录为cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒和SYBR PrimeScript? miRNA RT-PCT试剂盒（购自美国加利福尼亚州福斯特城）通过7900HT实时PCR系统（Applied Biosystems Inc.，美国加利福尼亚州福斯特城）测量mRNA和miRNA的表达水平。基因特异性引物：miR-506-3p正向5′-ACACTCATAAGGCACCCTTC-3′，反向5′-TCTACTCAGAAGGGGAGTAC-3′;Beclin-1正向：5'-CCATGCAGGTGAGCT TCGT-3'，反向：5'-GAATCTGCGAGAGACACCATC-3';U6正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3';β肌动蛋白正向：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，反向5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'。β肌動蛋白和U6分别用作mRNA和miRNA检测的内源参照。实验操作至少独立重复三遍，使用相对定量2-ΔΔCT方法分析数据。

1.2.3 细胞增殖检测：采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）检测转染48h后的细胞增殖效率，然后用微孔板在0h、24h和72h读取细胞增殖效率。首先，将转染的细胞以1.0×105个细胞/孔的密度接种在六孔板中，然后将8μl CCK-8和100μl无FBS的培养基添加到每个孔中，暗箱孵育2h。最后，在每个指示时间点通过测量450nm处的吸光度来检测细胞增殖。所有实验至少重复三遍。

1.2.4 荧光素酶报告基因检测：Beclin-1和miR-506-3p序列从美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）中检索。在线数据库TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_71/）用于预测miR-506-3p和Beclin-1 3'-UTR之间的结合位点。将Beclin-1 mRNA的野生型或突变型3'-UTR克隆到pmirGLO荧光素酶报告质粒（Promega，Madison，WI，USA）中。将HEK-293T细胞接种在24孔板中，并用荧光素酶报告基因转染。48h后，根据制造商的说明书，使用Dual-Luciferase Reporter基因分析系统（Promega Corporation，E1910）检测荧光素酶活性。所有实验至少进行三次。

1.2.5 蛋白质印迹分析：利用RIPA裂解缓冲液从烧伤的皮肤组织、正常组织和转染的HSAS4细胞中获得总蛋白裂解物，以10 000×g离心10min。然后，使用BCA蛋白测定试剂盒测量蛋白质浓度，通过SDS-PAGE分离每种样品中25μg蛋白质，并转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭1h后，将膜分别与第一抗体在4℃下孵育过夜，将β肌动蛋白设置为内源性对照。然后，将膜与第二抗体IgG在室温下再温育2h。最后，将蛋白质印迹可视化并用ECL-Plus Western Blot检测系统进行分析。所有实验至少重复三遍。

1.3 统计学分析：使用SPSS 22.0版软件进行数据分析。每次检测至少从三次实验中获得，并表示为均值±标准差。使用t检验对配对数据进行比较，并使用单向方差分析（ANOVA）进行两组以上的组间比较，P<0.05差异具有统计学意义。

2  结果

2.1 烧伤组织和热损伤成纤维细胞中miR-506-3p的表达：采用qRT-PCR检测30例患者烧伤组织及其毗邻正常组织中的miR-506-3p表达水平。与正常组织相比，烧伤组织中miR-506-3p的表达下调（见图1A）。同时，经52℃热处理后皮肤成纤维细胞的miR-506-3p表达低于未行热处理的对照组，且在48h时下调最明显（见图1B）。

2.2 miR-506-3p与Beclin-1靶向作用关系验证：采用在线生物信息学工具预测miR-506-3p的下游靶点，结果表明miR-506-3p可与Beclin-1 mRNA的3'-UTR结合（见图2A）。双重荧光素酶报告基因测定表明，用miR-506-3p模拟物转染后，WT-Beclin-1 3'-UTR的荧光素酶活性显著降低。而与对照组相比，荧光素酶活性在包含MUT-Beclin-1 3'-UTR的荧光素酶报告载体中无明显变化（见图2B）。

2.3 miR-506-3p可负调控成纤维细胞Beclin-1表达：使用qRT-PCR和Western blot分析检测miR-506-3p模拟物或抑制剂转染对Beclin-1表达的影响。结果显示，在热损伤皮肤成纤维细胞中，miR-506-3p的过表达导致Beclin-1在mRNA和蛋白水平上的表达均显著降低，而抑制miR-506-3p则增加了皮肤成纤维细胞Beclin-1的mRNA和蛋白表达水平（见图3A～B）。这些数据表明，miR-506-3p可直接与Beclin-1结合并负调控Beclin-1的表达。

2.4 miR-506-3p以剂量依赖性方式抑制热刺激下的细胞增殖：将浓度为10nM、30nM的miR-506-3p模拟物于体外转染，检测miR-506-3p在热刺激下成纤维细胞中的表达。结果表明，热刺激下调了miR-506-3p的表达，但用miR-506-3p模拟物转染后，以剂量依赖性方式逆转了这种作用（见图4A）。同时，用miR-506-3p模拟物转染也显著降低了热刺激成纤维细胞的生存力（见图4B）。这些结果表明，miR-506-3p的过表达能够抑制细胞增殖。

3  讨论

瘢痕是皮肤科和整形外科最常见的创伤后表现，是创伤后患者抱怨的一大问题，寻找瘢痕形成的机制及治疗靶点是临床治疗重要方向。目前miRNA及细胞自噬在纤维化疾病研究中备受关注，但在瘢痕形成中的生物学效应尚不明确。瘢痕形成是成纤维细胞异常增殖和胞外基质蛋白过度沉积所致，成纤维细胞作为瘢痕形成的主要效应细胞，研究成纤维细胞的自噬水平对瘢痕预防及治疗具有重要意义。大量文献表明，miRNA调控成纤维细胞的增殖、分化、凋亡等生物学效应，在瘢痕形成中存在异常表达[5]。例如，miR-181a通过PHLPP调节人瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡和增殖[6]。miR-181b-5p通过调节MEK/ERK/p21路径促进增生性瘢痕成纤维细胞的增殖并抑制其凋亡[7]。本次研究也证实，在烧伤皮肤组织和热刺激的皮肤成纤维细胞中，miR-506-3p表达显著下调，提示miR-506-3p与瘢痕形成具有显著关联，可作为瘢痕和纤维化疾病诊断及治疗的潜在靶点。

自噬与纤维化疾病密切相关，自噬参与瘢痕形成中成纤维细胞增殖、异常生长调控、细胞因子的分泌及基质的合成降解等，在瘢痕发生的各阶段发挥不同作用[8-9]。Beclin-1作为第一个被鉴定为哺乳动物自噬基因和酵母ATG6的直向同源物，是PI3KC3的重要成分，其參与自噬体形成，是至关重要的促自噬蛋白。有证据表明，miRNA参与了细胞自噬的调节并影响着瘢痕的形成。徐心雨发现miR-216b通过靶向调节Beclin-1表达实现由HPCT诱导的人眼Tenon囊成纤维细胞的自噬和凋亡水平[10]。Cao等[11]证明Beclin-1下调会显著抑制成纤维细胞活性和胶原蛋白合成，从而抑制肥厚性瘢痕的形成。在本研究中，通过生物信息学预测和双重荧光素酶报告基因分析评估，验证了Beclin-1是miR-506-3p的直接靶标，miR-506-3p可通过靶向Beclin-1调节烧伤组织成纤维细胞的行为。在进一步的研究中证实，miR-506-3p转录后靶向抑制Beclin-1表达。然而，miR-506-3p模拟物转染后，不仅显著降低热损伤成纤维的细胞生存力，并且以剂量依赖性方式逆转这种作用。因此，miR-506-3p靶向Beclin-1调控烧伤后皮肤成纤维细胞的自噬和增殖，这将可能被认为是伤口愈合的新治疗策略，但未来尚需进一步对miRNA和自噬进行研究以帮助人们更好地认识其抗瘢痕效应。

[参考文献]

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[3]Chen J，Yu Y，Li S，et al.MicroRNA-30a ameliorates hepatic fibrosis by inhibiting Beclin1-mediated autophagy[J].J Cell Mol Med，2017，21（12）：3679-3692.

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[10]徐心雨.miR-216b/Beclin-1对羟喜树碱诱导人眼Tenons囊成纤维细胞的自噬和调凋亡调节作用的研究[D].南京：南京医科大学，2014.

[11]Cao C，Wang W，Lu L，et al.Inactivation of Beclin-1-dependent autophagy promotes ursolic acid-induced apoptosis in hypertrophic scar fibroblasts[J].Exp Dermatol，2018，27（1）：58-63.

[收稿日期]2021-02-07

本文引用格式：史敏，丁欣强，郭晓波，等.miR-506-3p靶向Beclin-1调控烧伤后皮肤成纤维细胞的自噬和增殖机制研究[J].中国美容医学，2021，30（8）：95-98.