基于网络药理学探究芍药甘草汤保肝作用

李雪梅，白颖锋，杭爱武，陆兔林，毛春芹

（南京中医药大学，江苏 南京 210023）

肝脏是人体最大的实质性器官，在参与体内物质的储存、合成、吸收和代谢过程中起到至关重要的作用。因此，肝系疾病和肝损伤会严重威胁到人类的健康，而迫切找到能安全有效地阻断或逆转肝损伤的新疗法成为医药学领域的重中之重。具有中国传统文化特色的中医药在临床治疗过程中有着巨大的潜力，其临床治疗广泛性及安全性更是优势所在，在当代，具有保肝护肝作用的中药及其复方和制剂不乏其用。

中医辨肝损伤，以见其两胁作痛或胁下癥瘕，口苦，胸闷，纳差，身目发黄等症状作为诊断依据，来指导临床遣方用药。芍药甘草汤作为柔肝缓急止痛的基本方，出自《伤寒杂病论·辨太阳病脉证并治》，是张仲景为治疗伤寒夹虚误汗亡阳，阳复厥愈足温后脚挛急而设［1］，仅由白芍、甘草2 味药配伍而成，为酸甘化阴，调肝理脾之代表方。方中白芍酸寒，入肝、脾经，功善敛肝阴以养血，调理肝脾，柔肝止痛；甘草味甘性平，善缓急止痛，能入中焦而具有补脾益气之力。两药相伍，益阴敛阳，调和肝脾，缓急止痛，治疗脾虚肝旺脘腹挛急作痛或因阴血不足筋脉失养之四肢挛急而致痛。近年来，芍药甘草汤的临床应用越来越广泛，药理研究也更加深入。有文献报道称芍药甘草汤具有养血护肝，解毒止痛，降低转氨酶，消除黄疸等功效［2］。尝试构建“中药⁃成分⁃靶点⁃通路⁃疾病”网络图，旨在系统完整地找出芍药甘草汤发挥保肝作用的药效关键成分和药效部位，为更加深入地阐释白芍⁃甘草药对抗肝损伤的活性物质基础和作用机制提供参考，为药理研究和临床应用提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 中药潜在化学成分数据的整理与筛选 在中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP：http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）［3］中筛选白芍、甘草的化学成分，其中包括口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）和类药性（Drug⁃likeness，DL）。将OB≥30%，DL≥0.18 为条件筛选出潜在化学成分。检索日期为2019 年9 月。

1.2 预测并构建成分靶点集 在PubChem（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）［4］中搜集潜在活性成分的SMILE 结构式。通 过SwissTargetPrediction（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch／）［5］数据库和TargetNET（http：／ ／targetnet.scbdd.com）［6］数据库预测成分靶点。SwissTargetPrediction 数据库以可能性（probability）TOP30为纳入标准。TargetNET 数据库筛选符合里宾斯基五规则（Lipinski’ s Rule of Five）≥50%的成分进行预测，将得到的靶点以pro ＝1 为原则纳入数据，且均选择人类数据库（Homo sapiens）。检索日期为2019 年9 月。

1.3 预测并构建成分靶点集 通过DisGeNET（http：／ ／www.disgenet.org／web／DisGeNET／menu／home）［7］数据库的检索“Liver injury”“Liver disease”“hepatic injury”等关键词，筛选出疾病靶点，构建疾病靶点集。在Uniprot（http：／ ／www.uniprot.org／）［8］数据库 中获得 靶点的Uniprot ID，将成分预测靶点和疾病靶点进行标准化处理，并将两者取交集，得到中药治疗疾病的潜在靶点集。检索日期为2019 年9 月。

1.4 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析 通过生物学信息注释数据库（DAVID，https：／ ／david.ncifcrf.gov／）［9］的Functional Annotation 功能对潜在靶点集进行基因本体论（Gene Ontology，GO）富集分析及KEGG 通路富集分析。GO 富集分析由生物过程（Biological Process，BP）、细胞组分（Cell Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）3 个部分组成，三者均设置P＜0.05，且均选择人类数据库（Homo sapiens）。检索日期为2019 年9 月。

1.5 构建“中药⁃成分⁃靶点⁃通路⁃疾病”网络图 将整理的中药⁃成分⁃靶点⁃通路⁃疾病的数据导入Cytoscape3.2.1 软件中，构建网络图。

1.6 应用ROC 曲线评价白芍⁃甘草药对的共同靶点 利用GEO 数据库，找到与非酒精性脂肪肝相关（Non⁃alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的数据集，使用R 语言的limma 包作差异分析，围绕8 个相同靶点构建受试者工作特征曲 线（Receiver Operating Characteristic Curve，ROC 曲线），以血药浓度⁃时间曲 线下面积（Area Under Concentration⁃time Curve，AUC）评价药对白芍⁃甘草药对中对NAFLD 的治疗效应和诊断价值。

2 结果

2.1 白芍⁃甘草药对潜在活性成分与潜在靶点的筛选结果以OB≥30%，DL≥0.18 为条件，筛选出白芍活性成分10 个（删除3 个无标准SMILE 格式的成分），甘草活性成分73 个，见表1～2。通过SwissTargetPrediction 数据库和TargetNET 数据库预测并构建成分靶点集，得到白芍潜在活性成分靶点168 个，甘草潜在活性成分靶点515 个。

表1 白芍潜在活性成分

表2 甘草潜在活性成分

续表2

2.2 白芍⁃甘草药对抗肝损伤靶点的筛选结果 在DisGeNET 数据库中筛选出疾病相关靶点共605 个（删除重复靶点）。将芍药、甘草预测靶点分别与疾病靶点取交集，筛除重复信息，得到芍药⁃甘草药对与肝损伤疾病相关的靶点共77 个，其中白芍34 个，甘草72 个。

2.3 GO 富集分析与KEGG 通路富集分析 GO 富集分析结果显示，BP 分析结果222 个，包括凋亡过程的负调控、蛋白质磷酸化的正调控、类固醇激素介导的信号通路、细胞对缺氧的反应、内皮细胞增殖的正向调控、血管生成、炎症反应、药物反应、积极调控细胞增殖等作用途径；CC分析结果21 个，主要是包含膜筏、磷脂酰肌醇3⁃激酶复合物、细胞器膜、质膜、细胞外空间、蛋白质细胞外基质、膜、内质网膜、胞液等；MF 分析结果66 个，包括配体激活的序列特异性DNA 结合、酶结合、类固醇激素受体活性、磷脂酰肌醇3⁃激酶活性、1⁃磷脂酰肌醇⁃4⁃磷酸3⁃激酶活性、转录因子结合、磷脂酰肌醇⁃4，5⁃双磷酸3⁃激酶活性、药物结合、血红素结合等分子途径。

KEGG 通路富集分析得到85 条结果，筛选得到41 条通路与抗肝损伤有关，包括肾素⁃血管紧张素系统（ReninAngiotensin System，RAS）信号通路、缺氧诱导因子⁃1（hypoxia⁃inducible factor⁃1，HIF⁃1）信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、血管内皮生子因子（Vascular Endothelial Cell Growth Factor，VEGF）信号通路、破骨细胞分化、RAS 相关蛋白1（RAS⁃related protein 1，RAP1）信号通路、磷脂酰肌醇3⁃激酶（PI3K）／蛋白激酶B（AKT）信号通路、胰岛素抵抗、细胞凋亡、Fc epsilon RI 信号通路、B 细胞受体信号通路、乙肝和NAFLD 等。

将GO 富集分析与KEGG 富集分析结果按P 值升序排列，使用R 语言将结果TOP15 分别绘制成气泡图，其中气泡越大表示涉及靶点越多，颜色由蓝渐变至红表示与研究目的呈显著性升高态势。见图1。

图1 BP、CC、MF 及KEGG 富集分析结果（前15）

2.4 绘制“中药⁃成分⁃靶点⁃通路⁃疾病”网络图 将KEGG通路分析的结果整理出来，导入Cytoscape3.2.1 软件绘制“中药⁃成分⁃靶点⁃通路⁃疾病”网络图（图2），包括中药2个，成分77 个，靶点48 个，通路41 条，疾病1 个。根据自由度（Degree）由高到低筛选核心中药成分，包括（E）⁃1⁃（2，4⁃dihydroxyphenyl）⁃3⁃（2，2⁃dimethylchromen⁃6⁃yl）prop⁃2⁃en⁃1⁃one、Licoagroisoflavone（甘草异黄 酮）、glypallichalcone（刺甘草 查耳酮）、1⁃methoxyphaseollidin（1⁃甲氧基 菜豆素）、shinpterocarpin、licochalcone B（甘草查耳酮 B）、8⁃（6⁃hydroxy⁃2⁃benzofuranyl）⁃2，2⁃dimethyl⁃5⁃chromenol、glabrone（光果甘草酮）、licoisoflavanone（甘草异黄烷酮）、licoisoflavone B（甘草异黄酮B）、kaempferol（山柰酚）、（3S，5R，8R，9R，10S，14S）⁃3，17⁃dihydroxy⁃4，4，8，10，14⁃pentamethyl⁃2，3，5，6，7，9⁃hexahydro⁃1H⁃cyclopenta ［a］phenanthrene⁃15，16⁃dione、jaranol（栀子醇）、quercetin（槲皮素）、odoratin（芳香膜菊素）、licoagrocarpin、gadelaidic acid（反9⁃甘碳烯酸）、icos⁃5⁃enoic acid、quercetin der.、isoglycyrol（异甘草酚）、eurycarpin A（黄甘草异黄酮A）、（E）⁃3⁃ ［3，4⁃dihydroxy⁃5⁃（3⁃methylbut⁃2⁃enyl）phenyl］ ⁃1⁃（2，4⁃dihydroxyphenyl）prop⁃2⁃en⁃1⁃one、2⁃（3，4⁃dihydroxyphenyl）⁃5，7⁃dihydroxy⁃6⁃（3⁃methylbut⁃2⁃enyl）chromone、Gancaonin B（甘草宁B）、isotrifoliol、glyasperin F（粗毛甘草素F）、（2S）⁃2⁃ ［4⁃hydroxy⁃3⁃（3⁃methylbut⁃2⁃enyl）phenyl］ ⁃8，8⁃dimethyl⁃2，3⁃dihydropyrano［2，3⁃f］ chromen⁃4⁃one、lupiwighteone（黄羽扇豆魏特酮）、medicarpin（美迪紫檀素）、calycosin（毛异黄 酮）、xambioona、glyzaglabrin（光甘草轮）、licoisoflavone（甘草异黄酮）、5，7⁃dihydroxy⁃3⁃（4⁃methoxyphenyl）⁃8⁃（3⁃methylbut⁃2⁃enyl）chromone、3⁃（3，4⁃dihydroxyphenyl）⁃5，7⁃dihydroxy⁃8⁃（3⁃methylbut⁃2⁃enyl）chromone、gancaonin A（甘草宁A）、licochalcone G（甘草查耳酮G）、glepidotin A（鳞叶甘草素A）、semilicoisoflavone B、sitosterol（谷甾醇）、isorhamnetin（异鼠李素）、β⁃sitosterol（β⁃谷甾醇）、phaseol、gancaonin H（甘草宁H）、gancaonin G（甘草宁G）、7⁃acetoxy⁃2⁃methylisoflavone（7⁃乙酰氧 基⁃2⁃甲基异 黄酮）、HMO、isolicoflavonol（异甘草黄酮醇）、licoricone（甘草利酮）、7⁃methoxy⁃2⁃methyl isoflavone、glycyrol（甘草酚）、inermine、licochalcone a（甘草查耳酮 A）、formononetin（刺芒柄花素）、paeoniflorin（芍药苷）等。

图2 白芍⁃甘草药对抗肝损伤的“中药⁃成分⁃靶点⁃通路⁃疾病”网络图

网络图48 个靶点中，包括白芍15 个，甘草41 个，其中有8 个相同靶点，即CYP1A2、PIM1、PPARG、PTGS2、SYK 以及基质金属蛋白酶家族MMP9、MMP1、MMP2。为了更清晰地分析白芍⁃甘草药对的协同作用，将围绕以上8个相同靶点再次构建“中药⁃成分⁃靶点⁃通路⁃疾病”网络图（图3）。增强对芍药甘草汤保肝作用的微观整体认识。所构建的8 个靶点网络分析图显示，靶蛋白CYP1A2 的作用通路包括类固醇激素合成和药物代谢⁃细胞色素P450（drug metabolism cytochrome p450），PPARG 的作用 通路包 括PPAR 信号通路、破骨细胞分化和AMPK 信号通路，PIM1的作用通路是Jak⁃STAT 信号通路，PTGS2 的作用通路是脂解脂肪细胞的调节，SYK 的作用通路包括自然杀伤细胞介导的细胞毒性、NF⁃κB 信号通路、血小板活化、破骨细胞分化、PI3K⁃Akt 信号通路、FcγR 介导的吞噬作用、B 细胞受体信号通路、FcepsilonRI 信号通路、花生四烯酸代谢、VEGF 信号通路和TNF 信号通路，MMP1 的作用通路包括PPAR 信号通路，MMP2 的作用通路包括白细胞跨内皮迁移，MMP9 的作用通路包括TNF 信号通路、乙型肝炎和白细胞跨内皮迁移。

图3 “中药⁃成分⁃靶点⁃通路⁃疾病”网络图

2.5 ROC 曲线评价结果 在GEO 数据库中筛选得到符合条件的GSE37031 数据集［10］，将白芍、甘草的相同靶点输入验证集进行验证，并绘制ROC 曲线（图4）。AUC 分数在0.50～1 之间具有预测价值，0.70 以上说明诊断价值良好，0.90 以上说明诊断价值较高。如图所示，CYP1A2、PIM1、PTGS2、MMP9 的AUC 分数均处于0.70 以上，其中CYP1A2 和PTGS2 的AUC 分数超过0.9，表示在NAFLD 进程中，其诊断价值较高，且与健康对照组比较，疾病组的CYP1A2 和PTGS2 的表达具有显著差异（P＜0.05），其他相同靶点的表达不显著。

图4 ROC 曲线图

3 讨论

关于芍药甘草汤的药理研究及临床应用多集中于消化系统、内分泌系统、呼吸系统、神经系统和肿瘤癌症等疾病，近些年研究显示其还具有保肝作用。目前，该方针对保肝作用的药理实验仅为研究其有效组群芍甘多苷（含芍药总苷、甘草酸和总黄酮苷）的保护急性肝损伤作用［11］，或白芍和甘草单味药的有效成分保肝机理研究较多，但是关于芍药甘草汤整体保肝作用机制尚未有系统完整地挖掘分析，同时对白芍⁃甘草药对的其他化学成分和作用机制也鲜有报道。但因白芍⁃甘草药对配伍后其活性成分含量存在改变，且部分活性成分使用效用显著增强，如甘草可以促进芍药中芍药苷的吸收，芍药可提前助燃甘草中甘草次酸在体内出现的时间和数量［12⁃14］，所以本项研究通过筛选白芍⁃甘草药对中治疗肝损伤的活性成分，获取靶点，构建网络图，利用GO 及KEGG 分析其生物过程及信号通路，系统阐释了其具有保肝作用的活性成分和作用机制。

3.1 白芍⁃甘草药对存在多种潜在成分对肝损伤有抑制作用 通过研究发现，白芍⁃甘草药对治疗肝损伤的活性成分中主要包括甘草黄酮类化合物如甘草查耳酮A、毛异黄酮，以及山奈酚、槲皮素、异鼠李素、芍药苷、β⁃谷甾醇、刺芒柄花素和甘草酸及其衍生物等。最后筛选整理得到的成分中包括了大部分已被实验验证具有保肝作用有效成分，表明了研究数据的合理性。文献报道显示，白芍总苷有抗炎、镇痛，保肝等药理作用［15⁃16］。其中芍药苷对不同种类型肝损伤均有保护作用，例如通过NAFLD 及其多种信号途径来抑制肝胆固醇的脂质合成，可以保护肝脏抗氧化、抗炎、抗凋亡［17⁃20］。甘草黄酮类化合物、甘草酸及其衍生物对多种肝损伤有保护作用［21⁃26］。

与此同时，还存在多种潜在成分跟上述成分共同构成了白芍－甘草药对的抗肝损伤作用的物质基础，如山奈酚可减轻肝纤维化，具有抗氧化和保肝活性［25，27］。槲皮素是一种生物类黄酮，通过调控PI3K／Akt／NF⁃κB 信号通路来改善NAFLD 的肝组织脂肪变性程度，减轻肝脏炎症［28⁃29］。植物甾醇可抑制肝脏内胆固醇的生物合成和阻断致癌物诱发癌细胞形成等功能，有研究显示，β⁃谷甾醇能够提高免疫功能且具有一定抗肿瘤作用，可缓解DMN 诱导的肝脏损伤，防止胶原蛋白的积聚［30⁃31］。异鼠李素可抑制肝星状细胞活化，细胞外基质沉积和自噬，具有抑制肝纤维化的作用［32］。刺芒柄花素通过减少脂质过氧化作用，减少肝损伤并恢复肝细胞谷胱甘肽起到保护肝细胞的作用［33］。

3.2 白芍⁃甘草药对中重要潜在靶蛋白通过炎症通路、信号转导通路和其他相关通路对肝损伤有保护作用 根据筛选得到芍药甘草汤与肝损伤相关的活性靶点有48 个，其中包括白芍⁃甘草药对的相同靶点8 个，即CYP1A2、PIM1、PPARG、PTGS2、SYK 和基质 金属蛋 白酶家 族MMP9、MMP1、MMP2。围绕其相同靶点构建的“中药⁃成分⁃靶点⁃通路⁃疾病”网络图（图3）含88 个点，204 条边，表示这8 个靶点可视为白芍⁃甘草药对作为发挥药效的重要潜在靶点。以NAFLD 为例，ROC 曲线评价结果显示，靶蛋白CYP1A2 和PTGS2 具有显著意义。靶蛋白CYP1A2 的作用通路包括类固醇激素合成和药物代谢⁃细胞色素P450，药物代谢⁃细胞色素P450 中存在负责代谢异生物的酶，有研究表明，CYP 基因参与肝脏的异种生物和药物代谢，且其中的CYP1A2 可以在肝细胞中参与多种外来化合物及药物代谢［34⁃36］。PTGS2 具有抗氧化和抗炎作用，有助于改善肝损伤［37］，提示白芍⁃甘草药对配伍可能发挥协同作用，一方面调节CYP1A2 的转录，改变其活性，促进药物代谢，另一方面通过靶蛋白PTGS2 调节脂解脂肪细胞，在NAFLD 进程中有保护肝脏的作用。另外，靶蛋白SYK 的作用通路包括PI3K⁃Akt 信号通路、VEGF 信号通路、花生四烯酸代谢和TNF 信号通路等。PI3K⁃Akt 信号通路是参与细胞代谢、生长、凋亡和增殖的重要节点，能被多种类型的细胞刺激或毒性刺激所激活，蛋白一旦激活，Akt 即可通过磷酸化介导生长因子促增殖、抗凋亡发挥抗肝损伤作用［38⁃41］；VEGF又称血管渗透因子，其表达与肝纤维化和肝内血管增生有关［42⁃43］；花生四烯酸代谢物作为脂类介质在调节肝脏的生理和病理过程中起着重要作用，与其他致炎因子如自由基、TNF、IL⁃1 等共同介导肝损伤，通过干扰花生四烯酸可能对肝损有重要作用［44⁃48］。在基质金属蛋白酶家族有关的通路中，肝脏选择性MMP⁃9 抑制可防止肝脏VEGF 的蛋白分解，具有改善损伤，加速肝脏的再生的作用［49］，MMP9 的作用通路还包括白细胞跨内皮迁移通路，该通路与肝脏血管内发生缺血⁃再灌注损伤关系密切［50］。

结合“中药⁃成分⁃靶点⁃通路⁃疾病”网络图（图2）与KEGG 的分析结果显示，白芍⁃甘草药对的其他信号通路可能也是其发挥保肝作用的重要途径。包括Ras 信号通路、HIF⁃1 信号通路、Rap1 信号通路、胰岛素抵抗、细胞凋亡和NAFLD 等。RAS 的失衡与肝损伤的发生发展密切相关，通过调节Ras 信号通路的相关信号分子，可以抑制肝星状细胞活化和抗肝纤维化，通过阻断肝脏中RAS 对改善血脂状况和限制NAFLD 的进展具有潜在意义，可以改善胰岛素信号传导和调节脂肪细胞的增殖，对高脂饮食诱导的肝损伤具有保护作用［51⁃53］；缺氧是诱导肝脏局部炎症和血管生成的主要因子，可引起的相关炎症反应和纤维化，HIF⁃1 与VEGF 的表达在抗氧化和促进血管新生中发挥重要作用［54］；RAP1 是人肝细胞癌的一个重要的原癌基因，与细胞增殖、克隆形成和侵袭有关，肝细胞中眼缺失蛋白同源物4（eyes absent homolog 4，EYA4）通过抑制RAP1 反式激活可实现抗肿瘤作用，另外，通过抑制Rap1b 在肝细胞中的表达，可抑制氧化应激后肝细胞ERK 通路激活，热休克蛋白70（Heat Shock Protein 70，HSP70）的细胞保护作用以及肝细胞的抗氧化能力［55］。综上所述，白芍⁃甘草药对保肝作用与多条通路相关，如炎症通路、信号转导通路和其他相关通路，且这些通路是目前研究抗肝损伤的重要通路。

4 结论

通过网络药理学的方法，对芍药甘草汤具有保肝作用的潜在活性成分、靶点、作用通路及其机制有了更深一步的认识。研究结果显示，白芍⁃甘草药对发挥药效主要通过调节多种炎性因子，发挥抗炎、抗氧化作用，或者通过多种代谢途径，降低肝脏内的脂质水平，或者通过抑制细胞增殖和活化，达到保护肝脏的作用。药对的主要活性成分包括甘草黄酮类化合物如甘草查耳酮A、毛异黄酮，以及山奈酚、槲皮素、异鼠李素、芍药苷、β⁃谷甾醇、刺芒柄花素和甘草酸及其衍生物等，可能依靠CYP1A2、PTGS2、SYK 和基质金属蛋白酶家族MMP9、MMP1、MMP2 等靶蛋白，单独、相互或共同干预Ras 信号通路、HIF⁃1 信号通路、TNF 信号通路、VEGF 信号通路、Rap1 信号通路、Pl3k⁃akt 信号通路、胰岛素抵抗、细胞凋亡和NAFLD 等。另外，根据ROC 分析结果显示，白芍⁃甘草药对共同靶蛋白CYP1A2 和PTGS2 对NAFLD 具有较好的治疗效应和诊断价值，其作用途径与类固醇激素合成、药物代谢⁃细胞色素P450 和脂解脂肪细胞的调节密切相关。

本研究利用网络药理学方法探索了中药复方多成分、多靶点、多环节和多途径的作用特点，日前尚未能对芍药甘草汤抗肝损伤的主要靶点和通路及作用机制进行实验验证，有待后续进一步深入研究。