薯蓣丸联合环磷酰胺对乳腺癌小鼠上皮细胞EMT 的影响

张晨宇，谢 甦，谢 青，胡雅清，朱蔓荆，郑 丽

（1.贵州医科大学，贵州 贵阳550004； 2.贵州医科大学附属医院，贵州 贵阳550004； 3.邢台市医学高等专科学校，河北 邢台 054000）

乳腺癌威胁着全球女性的健康，乳腺癌位居危害女性健康的恶性肿瘤首位，其最主要的死亡原因是肿瘤的转移及复发［1］。根据预后因素，大约30%的淋巴结阴性和70%的淋巴结阳性的乳腺癌患者发生复发［2］。而患者治疗后死亡的主要原因是肿瘤的复发及转移，约有30%～40% 乳腺癌患者发展微转移性乳腺癌，转移性乳腺癌常常不可治愈，发现远处转移的乳腺癌患者，其生存期大约为2～3 年，仅仅只有5%～10%患者生存期在5 年以上［3⁃4］。因此了解其转移的机制对乳腺癌的早期诊断及治疗具有重要意义。本课题组在前期观察薯蓣丸对乳腺癌小鼠免疫功能的影响试验中发现，薯蓣丸可一定程度改善化疗后乳腺癌小鼠免疫抑制状态，得出可能是薯蓣丸增加CD4＋T 细胞的表达，激活NK 细胞，促进抗体的形成，使免疫细胞聚集到肿瘤周围，发挥抗肿瘤的作用；同时抑制CD8＋T 细胞的表达，减少免疫效应细胞的凋亡，增加免疫效应细胞的活化，加强了抗肿瘤免疫。在观察薯蓣丸对化疗后乳腺癌小鼠免疫功能的影响实验中发现，薯蓣丸有效升高乳腺癌小鼠白介素⁃2（IL⁃2）、γ⁃干扰素（INF⁃γ）等细胞因子的水平，并且白介素⁃10（IL⁃10）水平明显降低，即单核／巨噬细胞、NK细胞的活性增高，加强了乳腺癌小鼠的抗肿瘤能力。薯蓣丸可以调节小鼠免疫功能，上调INF⁃γ，抑制肿瘤坏死因子⁃α（TNF⁃α）的表达［5⁃6］。目前关于薯蓣丸作用于EMT还未见报道，因此，研究薯蓣丸联合化疗药物是否对乳腺癌EMT 具有抑制作用并探讨其机制具有重要意义。

1 材料

1.1 动物 健康BALB／c 小鼠24 只，雌性，6 周龄，体质量（20±2）g，由河北医科大学实验动物中心提供，饲养于河北省邢台市临床实验中心，动物生产许可证号SCXK（冀2018⁃004）。

1.2 细胞株 4T1 小鼠乳腺癌细胞株（中国科学院上海细胞库）。

1.3 药物 薯蓣丸浸膏由薯蓣20 g、甘草18 g、生晒参5 g、当归10 g、阿胶6 g、桂枝6 g、干地黄10 g、神曲10 g、川芎6 g、麦门冬5 g、芍药5 g、白术5 g、杏仁5 g、柴胡6 g、桔梗5 g、茯苓5 g、干姜3 g、白蔹3 g、防风5 g、大豆卷6 g、大枣30 g 组成，药材购自河北省邢台市同仁堂药房。根据人与动物间按体表面积折算的等效剂量换算小鼠的用量，一次取5 d 的药量进行煎熬，具体煎药步骤为向人工智能电煎药砂锅中加入300 mL 水，浸泡30 min，将煎好的药液浓缩至1.5 g 生药／mL，置于4 ℃冰箱中储存备用。化疗药物注射用环磷酰胺（批号19012025）购自江苏恒瑞医药股份有限公司。

1.4 试剂 胎牛血清、RPMI1640 培养基均购自美国Gibco公司（20181211）；E⁃cadherin（873704586681）、Vimentin（873704297104）、Akt（873704880277）、p⁃Akt（873704464396）等抗体购自美国CST 公司；SDS⁃PAGE 凝胶制备试剂盒（20180914）、BCA 蛋白测 定试剂 盒（20180908）均购自北京索莱宝科技有限公司，总RNA 小量制备试剂盒（20181124）购自美国Axygen 公司，逆转录试剂盒及实时荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa 公司（AHF1430A）。

1.5 仪器 免疫印迹实验中的所有设备均购自美国Bio Rad 公司；RT⁃PCR 仪器（CFX96 Optics Module）购自美国Bio Rad 公司。

2 方法

2.1 细胞培养 传代培养4T1 乳腺癌细胞株，使用含10%胎牛血清的RPM1640 培养基、置37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养，每天换液，待细胞长至90%～95%予以传代。

2.2 复制动物模型 将24 只BABL／c 小鼠随机分为模型组、环磷酰胺处理组和薯蓣丸联合环磷酰胺组，每组8 只。取对数期的4T1 乳腺癌细胞，用PBS 缓冲液将细胞重悬，调整细胞浓度约为1×106／mL，取细胞悬液0.1 mL，皮下接种于小鼠右侧下腹部，约7 d 即可形成5 mm×5 mm 左右的肿块。

2.3 给药 成瘤后，环磷酰胺组小鼠按100 mg／kg 的剂量腹腔注射注射环磷酰胺（用生理盐水定容至0.1 mL），1次／7 d，共21 d；薯蓣丸联合环磷酰胺组予在腹腔注射环磷酰胺（100 mg／kg）后，再每日予以薯蓣丸（15 mL／kg）灌胃处理；模型组则予以PBS 腹腔注射及灌胃处理。各组给药周期为21 d。

2.4 取材 第21 天，人道处死小鼠（处死前天晚上予小鼠禁食）并将其解剖，观察肿瘤转移情况，取其腹部肿瘤组织并将其剥离，观察色泽、质地并拍照记录，测量大小后装入提前标记的离心管并迅速至于液氮中，－80 ℃保存。抑瘤率＝ ［（模型组平均瘤重－给药组平均瘤重）／ 模型组平均瘤重］ ×100%。

2.5 Western blot 检测 检测小鼠皮下肿瘤中EMT 相关蛋白的表达，取粟粒大小组织至于研钵中，倒入液氮研至粉末状，加入适量裂解液（根据说明书要求），迅速将裂解的组织液吸入提前预冷的EP 管中，冰上充分裂解30 min，每5 min 涡旋振荡，4 ℃、12 000×g离心5 min。吸取离心后的上清溶液，保存于－80 ℃冰箱。BCA 法检测蛋白浓度。将蛋白与上样缓冲液混匀后煮沸5 min。每个泳道上样量为40 μg，首先以90 V 电压在浓缩胶中电泳，出现红色marker 后转为120 V，观察溴酚蓝进入到凝胶的下部边缘方可终止电泳。电转膜条件，230 mA 转膜2 h，转膜温度4 ℃。免疫反应，50 g／L 脱脂奶粉液封闭4 h，置于TBST中洗涤3 次，加入一抗（1 ∶ 1 000 稀释）室温孵育2 h，置于TBST 中洗涤3 次，再加入 二抗（1 ∶10 000）室温孵育80 min，TBST 洗 涤3 次。ECL 化学发 光法测 定E⁃cadherin、Vimentin、Akt、p⁃Akt 和内参GAPDH 条带的光密值，目的蛋白相对表达量＝目的蛋白光密度值／GAPDH 光密度值。实验重复3 次。

2.6 RT⁃ PCR 检测 检测小鼠皮下肿瘤中EMT 相关mRNA 的表达。取粟粒大小组织至于研钵中，倒入液氮研至粉末状，加入总RNA 提取试剂盒裂解试剂提取RNA，测提取RNA 浓度，并根据说明书要求体系进行反转录，步骤同反转录试剂盒。PCR 引物如表1 所示，采用2－ΔΔCt方法计算E⁃cadherin、Vimentin 的相对表达量。实验重复3 次。

表1 引物序列

2.7 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计软件，数据以（）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用Dunnett⁃t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组乳腺癌小鼠一般生长状态及肿瘤生长曲线 给药第6、9、12 天，与模型组相比，环磷酰胺组、薯蓣丸联合环磷酰胺组组肿瘤体积较小，生长速率减缓（P＜0.05）。给药第15、18、21 天，与模型组对比，环磷酰胺组、薯蓣丸联合环磷酰胺组肿瘤体积较小，生长速率减缓（P＜0.05）；薯蓣丸联合环磷酰胺组肿瘤体积较环磷酰胺组均减小，生长速率均减缓（P＜0.05）。环磷酰胺组、薯蓣丸联合环磷酰胺组抑瘤率分别为31.9%、45.2%。解剖过程中发现，模型组乳腺癌小鼠均有肺转移及骨转移情况，脾脏体积大、肿瘤体积较大、腹部占位严重；环磷酰胺组、薯蓣丸联合环磷酰胺组肿瘤肺转移、骨转移及腹膜淋巴转移率均低于模型组，肿瘤体积小、腹部各脏腑器官形态正常无挤压，造模过程中观察。模型组小鼠毛色逐渐失去光泽，活动逐渐减少，2 只小鼠下肢被肿瘤包围吞噬失去活动能力；给药组小鼠毛色较光泽，小鼠活动度好，生命体征完整。见图1～2。

图1 各组小鼠肿瘤体积生长曲线（n＝8）

3.2 各组乳腺癌小鼠瘤重 环磷酰胺组、薯蓣丸联合环磷酰胺组与模型组相比瘤重较轻，差异有统计学意义（P＜0.05）；薯蓣丸联合环磷酰胺组相比环磷酰胺组瘤重减轻，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组乳腺癌小鼠瘤重比较（）

表2 各组乳腺癌小鼠瘤重比较（）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与环磷酰胺组比较，△P＜0.05。

3.3 薯蓣丸联合环磷酰胺对瘤组织EMT 相关蛋白的影响与模型组比较，环磷酰胺组、薯蓣丸联合环磷酰胺组能上调E⁃cadherin 蛋白表达（P＜0.05），下调Vimentin、P⁃Akt／Akt 蛋白表达（P＜0.05）；与环磷酰胺组比较，薯蓣丸联合环磷酰胺 组 E⁃cadherin 蛋白表 达增加（P＜0.05），Vimentin、P⁃Akt／Akt 蛋白表达降低（P＜0.05）。见图3～4。

图2 各组乳腺癌小鼠解剖图

图3 Western blot 检测瘤组织E⁃cadherin、Vimentin、Akt 及P⁃Akt 蛋白表达

图4 薯蓣丸联合环磷酰胺对瘤组织EMT 相关蛋白的影响（n＝8）

3.4 薯蓣丸联合环磷酰胺对瘤组织EMT 相关mRNA 表达的影响 与模型组相比，环磷酰胺组和薯蓣丸联合环磷酰胺组能上调E⁃cadherin mRNA 表达（P＜0.05），下调Vimentin mRNA 表达（P＜0.05），薯蓣丸联合环磷酰胺组较环磷酰胺组明显（P＜0.05）。见图5。

图5 薯蓣丸联合环磷酰胺对瘤组织EMT 相关mRNA 表达的影响（n＝8）

4 讨论

乳腺癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤之一，占女性癌症第一位。近年来乳腺癌发病率明显上升［7］，其中肿瘤的转移及复发是威胁患者生命的重要原因，研究［8］表明有淋巴结累及的患者有更高的乳腺癌特异性死亡风险。EMT主要分子特征有细胞上皮表型如E⁃cadherin 表达下降或缺失，间质表型如Vimentin 等间质细胞标志物表达增强［9］。E⁃cadherin 介导细胞间黏附，维持细胞结构和形态的稳定，其缺失是上皮肿瘤细胞侵袭前提条件。E⁃cadherin 表达降低则细胞间黏附性下降，细胞脱落扩散，造成肿瘤细胞浸润转移［10］。Vimentin 存在于间充质细胞中，作为细胞骨架支撑维持细胞形态，在肿瘤细胞迁移、黏附、EMT 中均发挥作用［11］。

中医认为乳腺癌属于“乳岩”“乳石痈”等范畴［12］，是机体为七情所伤，引起五脏六腑虚损、气血不畅、脉阻交结，外加邪毒侵体，导致气滞血瘀于乳中而成。

本次探究中发现薯蓣丸联合环磷酰胺对于乳腺癌4T1小鼠中EMT 具有一定的抑制作用，且较单独使用化疗药明显，乳腺癌在中医临床治疗中更加注重扶正抗瘤［13］，再加上病人放化疗之后体虚加剧，故选择扶正培本的思路解毒扶正抗瘤。薯蓣丸作为医圣张仲景驱邪扶正的代表方，原载于《金匮要略·血痹虚劳病脉证并治第六》，文中载到：“虚劳诸不足，风气百疾，薯蓣丸主之”。“虚劳诸不足”即为阴阳气血俱不足的虚劳病人［14］，放化疗之后的病人身体阴阳气血俱虚，《素问》 有“正气存内，邪不可干”“邪之所凑，其气必虚”的记载；《医宗必读》 则曰：“积之成也，正气不足，而后邪气踞之”。中医对乳腺癌发病后的经络、脏腑、阴阳、血气变化早有翔实全面的认识，且从体质、情志因素等方面有着深入的研究，为临床诊治做出很大指导意义［15⁃18］。《金匮要略》 记载薯蓣丸中薯蓣三十分，当归、桂枝、神曲、干地黄、豆黄卷各十分，甘草二十八分，人参七分，川芎、芍药、白术、麦门冬、杏仁各六分，柴胡、桔梗、茯苓各五分，阿胶七分，干姜三分，白蔹二分，防风六分，大枣百枚为膏。整首方剂的配伍，除直接选取健脾益气的药对之外，调畅气机的药对，也是通过条达一身之气机，使脏腑功能恢复正常，以期达到扶正祛邪的目的，这又与调和营卫、升阳达表之药的目的不谋而合［19］，最终使人体阴平阳秘，恢复健康。

综上所述，薯蓣丸联合环磷酰胺可以提高化疗后小鼠E⁃cadherin 表达，降低Vimentin、Akt、p⁃Akt 表达，为今后临床对于乳腺癌的治疗和转移复发的防治提供了新的诊疗思路。