北五味子饮片等级标准及质量评价

尹程程，杨 洋，赵大庆，陈昊媛，张 旭，范莎莎，齐 滨*，睢博文*

（1.长春中医药大学，吉林省人参科学研究院，吉林 长春130117； 2.长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117）

北五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实，具有益气生津、收敛固涩、补肾宁心等功效［1］，始载于《神农本草经》，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种功效，对肝损伤、心血管疾病、神经系统、肿瘤、糖尿病等均有不同程度治疗作用［2⁃10］，主要含有木脂素类、多糖类、挥发油类［11］。中药有效成分的含量与饮片质量之间存在一定相关性［12］，为保证中药临床疗效，对其质量控制至关重要。北五味子为吉林省珍贵道地药材，由于市场行情波动较大，导致出现以次充好、“抢青”等现象，严重影响了其临床药效。

《七十六种药材商品规格标准》 及《中药材商品规格等级标准汇编》 均记载北五味子“呈不规则球形或椭圆形，皱缩，内有肾形种子1～2 粒。果肉微酸，种子有香气，味辛微苦。”并根据颜色、有无白霜、干瘪粒重对北五味子进行等级划分，但对于有白霜颜色鲜红者或无白霜颜色暗红者无法准确划分等级，并且等级划分忽略了有效成分对其的影响。本研究收集北五味子，并探讨外在指标与内在含量直接关联，以期为建立该药材等级划分体系提供参考。

1 材料

1.1 仪器 LC⁃2030 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KQ5200 型台式超声波清洗器（昆山美美超声仪器有限公司）；ST⁃40R 型高速冷冻离心机（美国赛默飞世尔科技有限公司）。

1.2 药物与试剂 对照品五味子醇甲（批号DST191010⁃010）、五味子醇乙（批号DST190807⁃013）、五味子甲素（批号DST190908⁃008）、五味子乙素（批号DST190819⁃009），纯度均≥98%，购自中国食品药品检定研究院。乙腈［色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；水为屈臣氏水。

1.3 饮片 北五味子饮片从不同产地收集而来，信息见表1，均由长春中医药大学肖井雷副教授鉴定为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件 Vision HT C18HL 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相乙腈（A）⁃水（B），梯度洗脱（0～40 min，45%～55%A；40～55 min，55%～61%A；55～75 min，61%～70%A）；体积流量0.8 mL／min；柱温35 ℃；检测波长250 nm。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取对照品五味子醇甲9.71 mg、五味子醇乙2.66 mg、五味子甲素2.28 mg、五味子乙素6.42 mg，置于量瓶中，甲醇定容至10 mL，即得。

2.1.3 供试品溶液制备 取北五味子粉末，过3号筛，精密称取0.25 g，加入25 mL 正己烷，称定质量，超声（250 W、50 kHz）处理30 min，正己烷补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液10 mL，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 精密度试验 精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液10 μL，在“2.1.1”项条件下连续进样6 次，得出五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面积RSD 分别为1.65%、1.70%、1.57%、1.86%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 精密称取北五味子6 份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项条件下于0、2、4、8、12、24 h 进样测定，得出五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面积RSD 分别为1.25%、0.39%、0.54%、0.47%，表明溶液在24 h 稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 精密称取北五味子6 份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项条件下进样，得出五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面积RSD 分别为0.96%、1.10%、0.63%、0.19%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液 0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL，甲醇稀释定容至5 mL，分别吸取10 μL，在“2.1.1”项条件下检测。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表2，表明各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.1.8 加样回收率试验 取北五味子（样品1）饮片粉末0.25 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，加入各对照品适量（五味子醇乙0.266 mg、五味子醇甲0.971 mg、五味子甲素0.228 mg、五味子乙素0.642 mg），混匀，在“2.1.1”项条件下检测，计算回收率，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.1.9 样品含量测定 取样品（1～50 号）各0.25 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液。各取10 μL，在“2.1.1”项色谱条件下进样，色谱图见图1，再计算含量，结果见表4。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 外观性状参数筛选 参考《七十六种药材商品规格标准》 及《中药材商品规格等级标准汇编》中划分北五味子等级的外观性状指标，结合2020年版《中国药典》 对北五味子性状的描述，选择干瘪粒质量占比作为指标进行测定。

2.3 内在质量参数筛选 北五味子药理活性主要与其木脂素类成分有关，占比2%～8%，已鉴定出来的多达31 种［13⁃14］。其中，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素含量较高，药理活性广泛，并且五味子醇甲为2020 年版《中国药典》 中北五味子含量测定项，因此本实验在进行等级研究时选择药理活性广泛、含量高的成分作为指标，同时参照2020 年版《中国药典》 测定北五味子杂质（通则2301）、水分（通则0832 第二法）、总灰分（通则2302），结果见表4。

表4 各样品内在指标测定结果（%）Tab.4 Measurement results for internal indices of various samples（%）

2.4 相关性分析 采用SPSS 软件，对影响北五味子外观性状、内在指标的干瘪质量占比、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、杂质、水分、总灰分、酸不溶性灰分进行相关性分析，结果见表5。北五味子干瘪粒质量占比与北五味子五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素及四种木脂素含量之和均有统计学意义（P＜0.01），并且均呈负相关；干瘪粒质量占比与五味子醇甲、五味子乙素呈强相关性，与五味子醇乙、五味子甲素呈一般相关性。

表5 Person 相关性分析结果Tab.5 Results of Pearson correlation analysis

2.5 主成分分析 主成分分析是一种能够通过采用降维和因子分析，将多个变量转化为较少的变量来获取原始数据中的大部分变异的统计学方法［15⁃17］。采用SPSS 22.0 软件对影响北五味子质量的相关指标进行分析，结果见表6，提取特征值＞0.5 的主成分，可得到3 个，见表7，分别对应因子1、因子2、因子3，累积贡献率可达95.12%。

表6 主成分初始特征值和贡献率Tab.6 Initial eigenvalues and contribution rates of principal components

表7 主成分矩阵与特征向量Tab.7 Principal components’ matrices and feature vectors

根据特征向量及累积贡献率建立主成分分析模型，具体如下。

F ＝59.367%F1＋20.901%F2＋14.852%F3；

F1＝0.504X1＋0.271X2＋0.418X3＋0.455X4＋0.526X5－0.118X6；

F2＝－0.096X1＋0.651X2－0.456X3＋0.316X4－0.040X5＋0.506X6；

F3＝0.064X1－0.445X2＋0.303X3＋0.044X4＋0.077X5＋0.836X6。

其中，X1、X2、X3、X4、X5、X6分别表示五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、4 种木脂素之和、干瘪粒质量占比这6 个原始变量标准化后的变量，F1、F2、F3表示3 个主成分的得分。以主成分贡献率对主成分得分进行加权平均得综合评分F，并按照模型进行评分，将得分大于0 者划分为一等，小于0 者划分为二等，对比市场分级方式（购买信息）、传统分级方式与模型分级方式，结果见表8。传统分级方式能够对大部分北五味子商品饮片进行很好的等级划分，但仍有样品难以判断其等级；模型分级方式可较为直观反映各产地北五味子质量情况，并且分级情况与商品本身所提供的等级基本一致。

表8 五味子市场、传统、模型分级比较Tab.8 Comparisons of Schisandra chinensis grades of market，tradition and model

2.6 正交偏最小二乘判别法分析（OPLS⁃DA）为进一步观察50 批样品差异，采用有监督模式的正交偏最小二乘判别法分析，见图2，各批样品经等级划分后具有很好的分离趋势，表明该模型的建立能根据质量对北五味子进行分类。如图3 所示，6 个指标对北五味子质量影响大小依次为干瘪粒质量占比＞4 种木质素之和＞五味子醇甲＞五味子甲素＞五味子乙素＞五味子醇乙。

图2 各样品OPLS⁃DA 得分散点图Fig.2 OPLS⁃DA score scatter plot of various samples

图3 变量重要性投影图Fig.3 Variable importance projection

2.7 质量等级划分 以有效成分含量为内在指标，干瘪粒质量占比为外在指标，采用主成分分析模型综合多个指标进行标准量化，结果见表8。最终，以五味子醇甲含量符合2020 年版《中国药典》 要求，即不低于0.4%、颜色红、无白霜、模型评分大于0 者为一等品；符合2020 年版《中国药典》要求，即颜色暗红、有或无白霜、模型评分小于0者为二等品，评分越高，表明饮片质量越好。

3 讨论与结论

北五味子以粒大、饱满为优，参考《七十六种药材商品规格标准》 《中药材商品规格等级标准汇编》 以及2020 年版《中国药典》 中对北五味子商品饮片的等级划分项，常以颜色、有无白霜、干瘪粒进行分级。但其中不乏其他大小不一的五味子混入。北五味子主要药效成分为木脂素类成分，同时富含有机酸［18］、萜类挥发油、多糖类成分，其中多糖类成分含量达85.56%［19］，挥发油含量可达12.2 mL／kg［20］。在储存过程中，丰富的挥发油及多糖类成分常导致北五味子饮片，出现油脂外溢、质地返软、发黏、颜色变深、气味散失等现象。这也使得不法商人以“抢青”货充当成熟北五味子的事时有发生。北五味子在长期储存过程中表面有结晶类物质析出，称“白霜”或“析霜”。

仅以色泽、有无白霜并不能完全代表其质量优劣，储存环境对北五味子外观性状的影响也可能是导致传统分级方式无法对某些批进行准确等级划分的原因。本研究等级划分模型建立时，由于颜色及有无白霜无法进行量化，综合考虑各参考文献所提及影响指标，采用可量化的且与质量相关的外观性状指标（干瘪粒质量），通过数学模型对北五味子各质量相关指标进行标准化，以评分形式对商品饮片等级进行划分。建立了能够快速、准确的对所购北五味子进行等级划分的方法。

综上所述，本实验收集50 批来源于不同道地产地的北五味子，以内在指标与外观性状指标建立等级划分数学评分模型，并结合不可量化的颜色、有无白霜等性状指标，建立较为全面的北五味子质量等级划分模式。