不同产地路路通体外抗肝肿瘤作用及谱效关系

杨欣欣 张云坤王 帅 李天娇包永睿*孟宪生

（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连116600； 2.辽宁省中药多维分析专业技术创新中心，辽宁 大连116600； 3.大连医科大学附属二院，辽宁 大连 116023）

路路通为金缕梅科植物枫香树Liquidambar formosanaHance 的干燥成熟果序，性味苦、平，归肝、肾经，具有祛风活络、利水、通经的功效［1］，生长于平原及丘陵地带，分布于我国华东、华南、西南等地，现代药理研究表明，其有保肝、抗肿瘤、抑制关节炎肿胀、消炎等作用［2］。研究发现，路路通药材中单体成分路路通酸对卵巢癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌等多种肿瘤具有良好的抑制作用［3⁃5］。但中药是多组分、多靶点综合作用的整体，其药效应由多种药效成分共同作用的结果［6］。路路通主要有挥发油、萜类、内酯类、黄酮类、有机酸及糖类等成分，其中挥发油、三萜类含量最为丰富［7］。探讨活性部位与抗肿瘤药效程度之间的关联性，明确路路通抗肿瘤的药效物质，将成为路路通药材在治疗肿瘤方面应用开发的关键科学问题。

本实验在明确路路通药材抗肿瘤药效部位为乙酸乙酯提取物的基础上，采用HPLC 法建立不同产地路路通药材指纹图谱［8］，采用人肝癌SMMC⁃7721 细胞体外模型开展不同产地路路通抗肝肿瘤药理药效研究；运用灰色关联及偏最小二乘分析法，将指纹图谱与药效进行关联，获得对药效功效较大的色谱峰。同时，采用UPLC⁃QTOF⁃MS 技术，对其乙酸乙酯药效部位的质谱峰与HPLC 法获得的色谱峰进行比对，明确色谱峰的精准分子量，找到在质谱及色谱中表达较高、色谱分离度较好的共有峰，开展谱效关系研究，并对其部分药效成分进行解析，以期待筛选出路路通抗肿瘤的药效物质基础，为其后期深度开发和临床应用提供前期实验依据。

1 材料

1.1 仪器 1290 型超高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Tecan sunrise 型酶标仪（瑞士帝肯公司）；US AUTOFLOW 型CO2培养箱（德国Nuaire公司）；E31 型倒置相差显微镜（Motic 公司）。

1.2 试剂与药物 人肝癌细胞株SMMC⁃7721（武汉博士德生物工程有限公司）。11 批路路通购自安国市启美药材有限公司，由辽宁中医药大学中药植物教研室许亮教授植物鉴定为金缕梅科植物枫香树Liquidambar formosanaHance 的干燥成熟果序，产地与编号分别为S1 江苏谪氏、S2 河北保定、S3 江苏祝文忠中医、S4 江苏民乐秦皇岛、S5 江苏成大方圆、S6 江苏祁一、S7 河北鼎辰、S8 河北安国鸿翔、S9 湖南裕宝堂、S10 江苏唐人、S11 四川。

1.3 样品制备

1.3.1 乙酸乙酯提取物 精密称取不同产地药材粗粉约100 g，置于具塞锥形瓶中，加入1 000 mL乙酸乙酯溶液，加热回流1 h，放冷，抽滤，挥干，即得。

1.3.2 供试品溶液 称取乙酸乙酯提取物约0.5 g，精密称定，置于25 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，称定质量，超声提取30 min，冷却后补足减失质量，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

1.3.3 含药培养液制备 称取乙酸乙酯提取物适量，加三级水（0.3% DMSO 助溶）制成质量浓度为2 mg／mL 的溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得，用于后期体外药效评价研究。

2 方法与结果

2.1 指纹图谱建立

2.1.1 色谱条件 Agilent poroshell 120 色谱柱（50 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流动相0.1% 甲酸（A）⁃乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min，5% B；10～110 min，5%～80% B）；体积流量0.8 mL／min；柱温30 ℃；进样量2 μL；检测波长254 nm。

2.1.2 质谱条件 电喷雾离子源，正、负离子模式测定；毛细管电压3 800 V；干燥气体体积流量10 L／min，温度280 ℃；雾化器压力45 psi（1 psi＝6.895 kPa）；鞘气温度350 ℃，体积流量12 L／min；碎裂电压150 V；质量范围m／z50～1 200。

2.1.3 精密度试验 精密吸取8 号供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下连续进样6 次，测得各色谱峰相对保留时间RSD 在0.29%～0.57%之间，相对峰面积RSD 在1.36%～2.76% 之间，均小于5%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 稳定性试验 制备8 号样品供试品溶液1份，于室温放置0、3、6、12、24、48 h 后 在“2.1.1”项色谱条件下进样，测得各色谱峰相对保留时间RSD 在0.21%～0.47%之间，相对峰面积RSD 在2.07%～3.49%之间，均小于5%，表明溶液在48 h 内稳定性良好。

2.1.5 重复性试验 制备8 号样品的供试品溶液6 份，在“2.1.1”项色谱条件下进样，测得各色谱峰相对保留时间RSD 在0.65%～1.36%之间，相对峰面积RSD 在2.96%～3.42%之间，均小于5%，表明该方法重复性良好。

2.1.6 指纹图谱建立 精密吸取11 批供试品溶液各2 μL，在“2.1.1”项色谱条件下进样，指纹图谱见图1，对照图谱见图2。

图1 11 批样品HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of eleven batches of samples

图2 不同产地样品乙酸乙酯提取物对照图谱Fig.2 Reference map for ethyl acetate extract of samples from different areas

在对不同仪器类型、色谱柱等指纹图谱适用性考察的基础上构建了指纹图谱，从中筛选出27 个主要色谱峰，得出其保留时间与峰面积，用于下一步谱效分析。

2.2 对人肝癌SMMC⁃7721 细胞的抑制作用 取培养2～3 d、处于对数生长期、生长状态良好的人肝癌SMMC⁃7721 细胞，1×PBS 清洗2 次，每次1 mL，1 mL 的胰蛋白酶消化，待细胞趋于变圆后培养液终止消化，并冲洗吹打制成细胞悬液，于细胞计数板上计数，加培养液稀释至浓度为5×104／mL，接种于96 孔培养板，每孔100 μL，继续培养约12 h待细胞贴壁完全。设加药试验孔、空白对照孔（加细胞不加药物），每组5 个复孔，继续培养24 h，每孔避光加20 μL MTT（5 mg／mL），继续于37 ℃培养箱中培养4 h 后吸净孔内上清液，每孔加入150 μL DMSO，摇床振摇10 min，用酶标仪在492 nm 处扫描，测定光密度（OD）［9⁃12］，结果见表1。

表1 不同产地样品乙酸乙酯提取物对人肝癌SMMC⁃7721 细胞的抑制率（， n＝3）Tab.1 Inhibitory effects of ethyl acetate extract of samples from different growing areas on human hepatocarcinoma SMMC⁃7721 cells（， n＝3）

表1 不同产地样品乙酸乙酯提取物对人肝癌SMMC⁃7721 细胞的抑制率（， n＝3）Tab.1 Inhibitory effects of ethyl acetate extract of samples from different growing areas on human hepatocarcinoma SMMC⁃7721 cells（， n＝3）

2.3 灰色关联度分析 先将影响整体行为的数据进行分列，以反映系统药效行为特征的数据序列（细胞的抑制率）为参考数列，即母序列；以影响系统药效行为的因素数据序列（不同产地路路通药材的不同峰面积经归一化处理后）为比较数列，即子系列。采用灰色关联度分析软件（Grey ModeLing_ V3.0）进行分析，得出不同极性药材色谱峰与体外药效学评价指标之间的关联系数［13⁃16］，见表2。

由此可知，这27 个主要色谱峰代表的化学成分对肝癌抑制作用有一定的差异性，其中相关系数大于0.7 的色谱峰为1、2、4、5、6、8、12、13、16、17、18、19、20、21、24、25、26 号，相关度依次为16th＞19th＞8th＞13th＞2th＞6th＞21th＞26th＞5th＞18th＞24th＞20th＞17th＞12th＞1th＞4th＞25th。

2.4 偏最小二乘回归分析 采用SPSS 17.0 统计软件，以归一化后的27 个主要色谱峰为自变量（X），药效数据为因变量（Y）进行偏最小二乘回归分析，结果见表3。回归方程为Y＝4.602 ＋0.068X1＋0.112X2＋0.063X3＋0.073X4－0.652X5－0.144X6－0.064X7－0.539X8－0.146X9－0.005X10－0.113X11＋0.023X12－0.460X13＋0.142X14－0.026X15＋0.013X16－0.226X17－0.155X18＋0.423X19－0.039X20＋0.054X21－0.045X22－0.020X23－0.021X24＋0.164X25＋0.429X26＋0.136X27。

表3 系数估计、累积变量重要性结果Tab.3 Results of coefficient estimation and cumulative variable importance

综合累积变量重要性结果，可见1、2、3、4、12、14、16、19、21、25、26、27 对药效贡献较大，起到正向促进作用。与灰色关联度分析比较，共有9 个色谱峰一致，相似度为75%。

2.5 HPLC⁃Q⁃TOF／MS 分析运 用 Agilent MassHunter Qualitative Analysis 软件对质谱图进行分析，寻找各个质谱峰所对应的分子量，推测分子式，找出质谱峰可能对应的化合物，并参考文献报道的化合物精准分子量，初步确定色谱峰对应的化合物，结果见表4。

表4 各样品乙酸乙酯提取物中化合物鉴定结果Tab.4 Identification results for compounds in ethyl acetate extract of various samples

3 讨论与结论

《黄帝内经》 认为，肿瘤是长期经络气血积聚、瘀滞导致邪阻络脉所致的结果，符合久痛入络、久病入络的发病机制［17］。现代中医也认为，经络系统与肿瘤病证发生发展及病证治疗有着极为密切的联系［18］。路路通果体多孔，归肝、肾经，有通行十二经之功效，为通经活络的常用中药。从中医治疗肿瘤的理论入手，找到路路通中抗肿瘤的活性单体，以期为疏经通络理论阐释及中药抗肿瘤研究提供参考。

本研究在前期路路通抗肝肿瘤药效物质确定的基础上，围绕活性部位抗肿瘤药效单体筛选这一科学问题，采用灰关分析、偏最小二乘回归2 种分析，获得了路路通抗肿瘤活性较强的1、2、4、12、16、19、21、25、26 号共9 个色谱峰，2 种分析方法相似性为75%，实验结果表明了2 种分析方法用于筛选药效成分的合理性。分析2 种方法结果差异性的由来，可能与灰关分析方法仅仅标识成分对药效的贡献，但不表示其正促进或是负抑制，而偏最小二乘回归分析方法获得是正促进的药效成分。

本课题组下一步将围绕药效单体成分定性、定量，药理药效评价，成分配伍及优化开展研究，期待较为全面的获得路路通药材抗肝肿瘤的药效物质，以期为其抗肿瘤药物研发、临床应用及作用机制研究奠定基础。