灰树花多糖对宫颈癌细胞增殖和转移的影响及机制

周跃闻，郑昌婧，高香宏

（唐山职业技术学院妇产科教研室，河北 唐山 063000）

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，近些年的发病率升高，且呈现出年轻化的趋势，严重威胁女性的生命健康［1］。目前，手术切除结合放化疗是宫颈癌治疗的主要方法，但即使使用综合治疗方案，患者的预后仍不理想［2］。因此，寻找有效的宫颈癌治疗方法有重要意义。

灰树花又名贝叶多孔菌，是一种药食同源植物，具有多种生物活性。研究表明，灰树花多糖具有明显的抗肿瘤活性，如Zhang 等［3］研究显示，灰树花多糖可通过线粒体凋亡途径诱导乳腺癌细胞凋亡；Rocalema 等［4］研究显示，灰树花多糖对结肠癌细胞增殖和侵袭有抑制作用，但它在宫颈癌中的研究较少。前期发现，灰树花多糖可通过下调生存素survivin 及上调半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase⁃3）基因表达诱导宫颈癌细胞凋亡［5］。磷脂酰肌醇3⁃激酶／蛋白激酶B（PI3K／AKT）信号通路是一条抗凋亡、促存活的经典信号转导途径，在肿瘤发生发展及化疗抵抗中有明显作用［6⁃7］。另外，抑制PI3K／AKT 信号通路可明显降低宫颈癌细胞生长［8］，但灰树花多糖是否可阻断PI3K／AKT 信号通路从而抑制宫颈癌细胞生长还未明确。因此，本研究旨在探讨灰树花多糖对宫颈癌细胞增殖、侵袭迁移和凋亡的影响，并进一步研究对PI3K／AKT信号通路的调控作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与药物 灰树花多糖（纯度50%，批号20181020）购自浙江方格药业有限公司。小牛血清（批号 20170210）、DMEM 培养基（批号20181105）、胰酶均购自美国Hyclone 公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）（批号20171203）、二甲基亚砜（DMSO）（批号20180320）、LY294002（批号20180110）均购自美国Sigma 公司；Transwell 小室（批号 20171120）、Matrigel 基质胶（批 号20171201）均购自美国Coming 公司；Annexin V⁃FITC／PI 双染细胞凋亡试剂盒（批号20181005）、标记缓冲液（Binding Buffer）（批号20181205）、流式细胞仪均购自美国BD 公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（批号20171215）、RIPA裂解液（批号20180410）均购自江苏碧云天生物技术有 限公司；AKT（ab8805）、p⁃AKT（ab8933）、增殖细 胞核抗 原（PCNA）（ab181973）、剪切型caspase⁃3（Cleaved caspase⁃3）（ab2302）、E⁃钙黏蛋白（E⁃cadherin）抗体（ab227639）均购自英国Abcam 公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG（ab205718）、电化学发光（ECL）检测试剂盒（20180510）均购自美国Santa Cruz 公司。酶标仪购自美国Bio⁃Rad 公司。

1.2 细胞培养 人宫颈癌Caski、C33A 细胞株购自美国ATCC 公司。细胞常规复苏后，置于5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，培养液为含10%小牛血清的培养基，每隔48 h 换液1 次，待细胞在培养瓶铺满80%～90%时进行传代。实验时，取生长至对数期的第4 代Caski 细胞。

1.3 细胞增殖检测 取对数期Caski、C33A 细胞，胰酶消化细胞，终止消化后离心收集细胞，制成细胞悬液，细胞计数后以1×104个／孔接种于96 孔板，每孔加入细胞悬液100 μL。置于5% CO2、37 ℃培养箱培养，细胞单层铺满96 孔板底后，使用灰树花多糖（终质量 浓度为50、100、200 μg／mL）、LY294002（10 μmol／L）或LY294002＋灰树花多糖（10 μmol／L LY294002 和200 μg／mL 灰树花多糖）处理细胞，并设置仅加入培养基者作为对照组，每组5 个复孔，于培养箱中常规孵育48 h，每孔中加入10 μL MTT 溶液（5 mg／mL），4 h后终止培养，每孔中加入DMSO 150 μL，于摇床上低速振荡10 min，结晶充分溶解后，酶标仪测定490 nm 波长处各孔光密度（OD），重复3 次。

1.4 细胞侵袭、迁移能力检测 预先使用无血清培养基稀释基质胶（5 ∶1），平铺在聚碳酸酯微孔滤膜上，37 ℃放置3 h 后转至室温风干，将铺好基质胶的Transwell 小室放置于24 孔细胞培养板中，下室每孔中加入500 μL 无血清培养的Caski 细胞上清液。使用灰树花多糖（终质量浓度为50、100、200 μg／mL）、LY294002（10 μmol／L）或LY294002＋灰树花多糖（10 μmol／L LY294002 和200 μg／mL 灰树花多糖）处理细胞48 h，离心，无血清培养基将细胞浓度调整为5×104／mL，取200 μL细胞悬液加入Transwell 小室上室中，于培养箱中常规培养18 h，取出小室，棉签轻柔擦掉小室上室细胞，4% 多聚甲醛固定，0.1% 结晶紫染色。在高倍显微镜下随机选择5 个视野（上、中、下、左、右），计数穿膜细胞数，拍照，取平均值，重复3 次。

1.5 细胞凋亡率检测 胰酶消化生长至对数期的Caski 细胞，终止消化后离心收集细胞，制备成细胞悬液，以2.5×105／孔接种细胞于6 孔板，于培养箱中常规孵育，细胞达70%～80%生长融合时，使用灰树花多糖（终质量浓度为50、100、200 μg／mL）、LY294002（10 μmol／L）或LY294002＋灰树花多糖（10 μmol／L LY294002、200 μg／mL 灰树花多糖）处理细胞，仅加入培养基者作为对照组，每组设置3 个复孔。培养48 h 后，胰酶消化细胞，离心，弃掉上清，预冷PBS 洗涤细胞，轻摇使细胞悬浮，离心，弃掉上清，重复洗涤2 次，加入400 μL 结合缓冲液重悬细胞，避光环境加Annexin V⁃FITC染料10 μL，混匀，4 ℃孵育10 min，然后加入PI染料5 μL，混匀，4 ℃孵育10 min，上机前再加入结合缓冲液300 μL，1 h 内通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，重复3 次。

1.6 AKT、p⁃AKT、PCNA、Cleaved caspase⁃3、E⁃cadherin 蛋白表达检测 收集灰树花多糖（终质量浓度为50、100、200 μg／mL）、LY294002（10 μmol／L）或LY294002 ＋灰树花多糖（10 μmol／L LY294002和200 μg／mL 灰树花多糖）处理48 h 的Caski 细胞，PBS 洗涤细胞2 次。加入适量放射免疫沉淀测定（RIPA）裂解液，在冰上反应30 min，离心，收集上清，BCA 法测定蛋白浓度，在适量蛋白中加入5×loading buffer，100 ℃水浴锅中10 min，即得最终的蛋白样品。按照30 μg／孔上样，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转聚偏氟乙烯（PVDF）膜及膜封闭，将封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入稀释后的AKT、p⁃AKT、PCNA、Cleaved caspase⁃3和E⁃cadherin 抗体（1 ∶500），封口，4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜3 次，加入HRP 标记的二抗（1 ∶2 000），室温1 h，TBST 洗膜，膜上滴加ECL 显色液，曝光显影，Quantity One 软件分析条带灰度值，重复3 次。

1.7 统计学分析 通过SPSS 21.0 软件进行处理，计量资料以（）表示，多组间差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采SNK⁃q 检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 灰树花多糖对宫颈癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响 不同质量浓度灰树花多糖对宫颈癌Caski、C33 A 细胞增殖均有抑制作用（P＜0.05），并呈现浓度依赖性，选择抑制作用更明显的Caski细胞为研究对象。Transwell 小室检测结果显示，不同浓度的灰树花多糖对Caski 细胞侵袭和迁移能力均有抑制作用（P＜0.05，P＜0.01），并呈现浓度依赖性。见表1、图1。

图1 不同质量浓度灰树花多糖对Caski 细胞侵袭、迁移的影响（×200）Fig.1 Effects of Grifola frondosa polysaccharide with different concentrations on the invasion and migration of Caski cells（×200）

表1 不同质量浓度灰树花多糖对Caski 细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡的影响（， n＝3）Tab.1 Effects of Grifola frondosa polysaccharides with different concentrations on the proliferation，invasion，migration and apoptosis of Caski cells（， n＝3）

表1 不同质量浓度灰树花多糖对Caski 细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡的影响（， n＝3）Tab.1 Effects of Grifola frondosa polysaccharides with different concentrations on the proliferation，invasion，migration and apoptosis of Caski cells（， n＝3）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2 灰树花多糖对Caski 细胞凋亡的影响 随着灰树花多糖质量浓度增加，细胞凋亡率升高，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），并呈现出浓度依赖性，见表1、图2。

图2 不同质量浓度灰树花多糖对Caski 细胞凋亡的影响Fig.2 Effects of Grifola frondosa polysaccharide with different concentrations on the apoptosis of Caski cells

2.3 灰树花多糖对AKT、p⁃AKT、PCNA、Cleaved caspase⁃3、E⁃cadherin 表达的影响 与对照组比较，灰树花多糖组p⁃AKT、PCNA 表达降低，Cleaved caspase⁃3、E⁃cadherin 表达升 高（P＜0.05，P＜0.01），并呈浓度依赖性，见图3、表2。

表2 各组AKT、p⁃AKT、PCNA、Cleaved caspase⁃3 和E⁃cadherin 蛋白相对表达（， n＝3）Tab.2 Relative expressions of AKT，p⁃AKT，PCNA，Cleaved caspase⁃3 and E⁃cadherin proteins in various groups（，n＝3）

表2 各组AKT、p⁃AKT、PCNA、Cleaved caspase⁃3 和E⁃cadherin 蛋白相对表达（， n＝3）Tab.2 Relative expressions of AKT，p⁃AKT，PCNA，Cleaved caspase⁃3 and E⁃cadherin proteins in various groups（，n＝3）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

图3 灰树花多糖对AKT、p⁃AKT、PCNA、Cleaved caspase⁃3、E⁃cadherin 表达的影响Fig.3 Effects of Grifola frondosa polysaccharide on the expressions of AKT，p⁃AKT，PCNA，Cleaved caspase⁃3 and E⁃cadherin

2.4 LY294002 增强灰树花多糖对Caski 细胞增殖、侵袭、迁移能力的抑制作用 LY294002 可抑制Caski 细胞增殖、侵袭、迁移能力，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；与灰树花多糖联合处理后上述作用增强，与LY294002 组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），见图4、表3。

图4 LY294002 单独或联合灰树花多糖对Caski 细胞侵袭、迁移的影响（×200）Fig.4 Effects of LY294002 alone or in combination with Grifola frondosa polysaccharide on the invasion and migration of Caski cells（×200）

2.5 LY294002 增强灰树花多糖对Caski 细胞凋亡的促进作用 LY294002 可促进Caski 细胞凋亡，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；与灰树花多糖联合处理后上述作用增强，与LY294002 组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），见图5、表3。

图5 LY294002 单独或联合灰树花多糖对Caski 细胞凋亡的影响Fig.5 Effects of LY294002 alone or in combination with Grifola frondosa polysaccharide on the apoptosis of Caski cells

表3 LY294002 单独或联合灰树花多糖对Caski 细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响（， n＝3）Tab.3 Effects of LY294002 alone or in combination with Grifola frondosa polysaccharide on the proliferation，invasion，migration and apoptosis of Caski cells（， n＝3）

表3 LY294002 单独或联合灰树花多糖对Caski 细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响（， n＝3）Tab.3 Effects of LY294002 alone or in combination with Grifola frondosa polysaccharide on the proliferation，invasion，migration and apoptosis of Caski cells（， n＝3）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与LY294002 组比较，＃＃P＜0.01。

2.6 LY294002 单独或联合灰树花多糖对Caski 细胞AKT、p⁃AKT、PCNA、cleaved Caspase⁃3、E⁃cadherin 表达的影响 与对照组比较，LY294002组p⁃AKT、PCNA 表达降低（P＜0.01），Cleaved caspase⁃3、E⁃cadherin 表达升 高（P＜0.01）；与LY294002 组比较，LY294002 ＋灰树花多糖组p⁃AKT、PCNA 表达降 低（P＜0.01），Cleaved caspase⁃3、E⁃cadherin 表达升高（P＜0.01），见图6、表4。

表4 各组AKT、p⁃AKT、PCNA、Cleaved caspase⁃3 和E⁃cadherin 蛋白相对表达（， n＝3）Tab.4 Relative expressions of AKT，p⁃AKT，PCNA，Cleaved caspase⁃3 and E⁃cadherin proteins in various groups（，n＝3）

表4 各组AKT、p⁃AKT、PCNA、Cleaved caspase⁃3 和E⁃cadherin 蛋白相对表达（， n＝3）Tab.4 Relative expressions of AKT，p⁃AKT，PCNA，Cleaved caspase⁃3 and E⁃cadherin proteins in various groups（，n＝3）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与LY294002 组比较，＃＃P＜0.01。

图6 LY294002 单独或联合灰树花多糖对Caski 细胞AKT、p⁃AKT、PCNA、Cleaved caspase⁃3、E⁃cadherin 表达的影响Fig.6 Effects of LY294002 alone or in combination with Grifola frondosa polysaccharide on the expressions of AKT，p⁃AKT，PCNA，Cleaved caspase⁃3 and E⁃cadherin in Caski cells

3 讨论

近些年来，从植物中分离纯化有效的活性成分是肿瘤治疗的新趋势。越来越多的研究证实，一些天然的植物或产物的提取物对肿瘤有抑制作用，且方便获取，对人体毒性小，可作为肿瘤治疗的替代或治疗外的补充剂［9⁃10］。灰树花是一种食药两用菌，可长期食用，由灰树花提取出的多糖无任何毒副作用，无论是口服还是注射均表现出相似的抗肿瘤活性［11］。灰树花多糖可抑制卵巢癌细胞增殖及诱导细胞凋亡［12］；灰树花多糖可促进肝癌细胞凋亡，与维生素C 连用对细胞凋亡诱导作用更明显［13］。灰树花多糖可能通过激活氧化应激信号从而促进肺癌细胞凋亡［14］。本研究检测不同浓度灰树花多糖对宫颈癌Caski 细胞生长的影响，结果显示，随着灰树花多糖质量浓度增加，Caski 细胞增殖、侵袭和迁移能力均明显降低，凋亡率升高，提示灰树花多糖对宫颈癌细胞生长有明显抑制作用。

PI3K／AKT 信号通路是一条重要的信号途径，在人类的绝大多数肿瘤中异常激活，AKT 是一种原癌基因，是PI3K 激活后的下游效应分子，也是该通路的核心，其发生磷酸化的程度可反映该信号途径激活程度［15⁃16］。抑制PI3K／AKT 信号通路可明显降低多种肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋亡［17⁃18］。LY294002 是PI3K／AKT 信号通路抑制剂，可特异性抑制AKT 的磷酸化，抑制宫颈癌细胞生长［19］。本研究结果显示，LY294002 可明显抑制Caski 细胞增殖、侵袭和迁移能力，促进细胞凋亡，下调p⁃AKT 表达，且可增加灰树花多糖对Caski 细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡及p⁃AKT 表达的影响。提示灰树花多糖可能通过阻断PI3K／AKT信号通路抑制宫颈癌细胞生长。

细胞凋亡又称程序性死亡，caspase⁃3、PARP等多种蛋白负责调控凋亡的关键过程，caspase⁃3是caspase 家族关键酶，处于凋亡级联反应的下游，其活化可使凋亡不可逆［20］。上皮间质转化（EMT）是指上皮细胞向间质细胞转化的现象，EMT 与肿瘤侵袭转移密切相关，抑制EMT 可降低肿瘤细胞侵袭转移［21］。E⁃cadherin 是衡量是否发生EMT 的标志。有研究表明，活化后的AKT 可通过调节下游PCNA、caspase⁃3、E⁃cadherin 表达而影响细胞生长［22⁃23］。本研究结果显示，LY294002 和灰树花多糖均可下调PCNA 表达，上调caspas⁃e3 和E⁃cadherin 表达，且两者联合使用对PCNA、caspase⁃3 和E⁃cadherin 表达影响更明显。

综上所述，灰树花多糖可抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋亡，机制可能与阻断PI3K／AKT 信号通路有关。提示灰树花多糖可能是宫颈癌治疗的有效途径，但还需更多研究证实。