知母皂苷B⁃Ⅱ抑制秀丽隐杆线虫Aβ 蛋白毒性作用及机制研究

宗茹敏王雅丽黄 琪 郑良超徐国兵吴德玲*

（1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥230012； 2.中药饮片制造新技术安徽省重点实验室，安徽 合肥230012； 3.安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥 230012）

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种神经系统退行性疾病，表现为渐进性记忆减退、认知功能障碍，Aβ 的沉淀和聚集所形成的老年斑是AD 较明确 的致病因子。知母皂苷B⁃Ⅱ（timosaponin B⁃Ⅱ，TSB⁃Ⅱ）为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的主要成分与活性物质，可改善痴呆大鼠的学习记忆能力［1⁃2］，发挥抗痴呆作用。

秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans属于线性动物门，具有生存周期短、易于培养操作等特点，已完成全基因组测序，约40%的基因与人类同源，而且神经细胞发达，有利于其用于神经方面的疾病研究。CL4176 线虫在肌肉细胞中表达人类β⁃淀粉样蛋白1⁃42（Aβ1⁃42），升高温度可诱导Aβ1⁃42表达量增加，导致线虫瘫痪，可通过线虫瘫痪表型变化判断药物的有效性［3］。daf⁃16 mRNA 是与寿命胰岛素daf⁃16／FOXO 信号通路相关基因，对线虫寿命的延长起正向调节作用；sod⁃3 作为daf⁃16 的靶基因，可通过催化O2⁃的去除来保护机体免受氧化应激；skn⁃1 mRNA 表达也能在一定程度上延缓氧化损伤；hsp⁃16.2 作为一种经Aβ 诱导产生的低分子量多肽，可减轻毒性蛋白质累计造成的损伤，其过度表达抑制瘫痪表型的作用也已被证明。目前，关于TSB⁃Ⅱ抑制转基因秀丽隐杆线虫体内Aβ 聚集作用及机制鲜有报道，故本实验以秀丽隐杆线虫CL4176 为模型，通过线虫瘫痪、寿命、体内活性氧水平、氧化应激、热应激等实验探讨TSB⁃Ⅱ抑制Aβ 蛋白毒性作用及可能的机制，以期为AD 治疗提供理论基础。

1 材料

野生型秀丽隐杆线虫N2、转基因秀丽隐杆线虫CL4176 ｛dvIs27 ［pAF29（myo⁃3／A⁃Beta 1⁃42／Iet UTR）＋pAF4（rol⁃6（su1006）］｝购于美国线虫基因中心（CGC）；大肠杆菌（Escherichia coliOP50 株）受赠于中国科技大学生命科学院光寿红教授。TSB⁃Ⅱ对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号100420，纯度＞98%）。Aβ1⁃42（上海信裕生物工程有限公司，批号XY⁃E11405）；ECL 化学发光检测试剂盒、BCA 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号P0018AS、批号P0012S）；细胞蛋白裂解液（福州飞净生物科技有限公司，批号PH0406）；Trizol（美国Life Technogies 公司，批号15596018）；DEPC⁃H2O（上海捷瑞生物工程有限公司，批号D1007）；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus（美 国 Anovoprotein 公 司，批 号E096⁃01）；RevertAidTM firsStrand cDNASynthesis Kit（批 号K1622）、荧光定量PCR 仪（型号PIKOREAL 96）（美国Thermo Scientific 公司；体式显微镜（宁波舜宇仪器有限公司，型号Motic K⁃400C）；荧光酶标仪［美谷分子仪器（上海）有限公司，型号SpectraMax M4］；普通PCR 仪（杭州晶格科学仪器有限公司，型号K960）；引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司进行。

2 方法

2.1 NGM 固体培养基（线虫生长培养基）与M9溶液的制备及线虫同步化 参考文献［4⁃5］ 报道的方法制备NGM 固体培养基与M9 溶液，对配置好的NGM 培养基进行铺板，凝固后倒置，在4 ℃冰箱中保存。对线虫进行同步化培养，然后将其转移至NGM 培养皿中，于20 ℃培养箱中恒温培养。

2.2 TSB⁃Ⅱ溶液制备 取适量TSB⁃Ⅱ，超纯水溶解成960 μg／mL 母液，除菌滤头过滤后加入大肠杆菌OP50 配置成质量浓度为640、160、40、10、2.5、0.625 μg／mL 的溶液，各取300 μL 铺在NGM 板中，每个质量浓度铺3 块板。

2.3 瘫痪实验 用M9 缓冲液将产卵期CL4176 线虫洗至离心管进行离心处理，弃去上清液，重复3次后加入与M9 等体积的裂解液，待线虫全部裂解后离心，弃去上清液，将虫卵铺在新的NGM 板中，于16 ℃下培养至孵化成蠕虫后，转移至TSB⁃Ⅱ的各给药浓度组，升温至25 ℃诱导Aβ1⁃42基因表达和线虫瘫痪。用挑针轻触线虫，线虫保持头动而身体不动，则判定为瘫痪［6］。

2.4 寿命实验 产卵期CL4176 线虫同步化后，将虫卵铺于NGM 板中16 ℃孵化12 h 后转移至TSB⁃Ⅱ的3 个最佳给药浓度组（TSB⁃Ⅱ⁃40、TSB⁃Ⅱ⁃10、TSB⁃Ⅱ⁃2.5）及空白组培养，每个浓度平行3 块板，每3 d 记录线虫存活情况，直至全部死亡为止，对其寿命做生长曲线，考察TSB⁃Ⅱ对转基因线虫是否有毒性作用［7］。用挑针轻触线虫头部和尾部，若30 s 内均无反应，则判定为死亡。

2.5 活性氧（ROS）检测 产卵期CL4176 线虫同步化后，将虫卵铺在NGM 板上孵化，转移至TSB⁃Ⅱ的3 个最佳给药浓度组（TSB⁃Ⅱ⁃40、TSB⁃Ⅱ⁃10、TSB⁃Ⅱ⁃2.5）及空白组，于16 ℃培养36 h，升温给药板至25 ℃培养36 h，将线虫于EP 管中用PBS 冲洗3 次后，在含H2DCF⁃DA 的PBS⁃T 中孵育3 h，每10 min 涡旋1 次，荧光酶标仪于温度37 ℃、激发光波长485 nm、发射光波长530 nm 下测定荧光强度［8］，平行3 次。

2.6 Aβ 体外沉积实验 将适量Aβ1⁃42用六氟异丙醇（HFIP）冰浴超声10 min，溶解成质量浓度为1 mg／mL，吹去HFIP，将管内壁透明的肽层溶于DMSO 中，PBS 稀释成浓度为0.025 mmol／L 的溶液。取Aβ 淀粉样蛋白10 μL、不同浓度TSB⁃Ⅱ组20 μL，加到96 孔板中混合均匀后，于37 ℃下避光孵育，加入用0.1 mol／L 甘氨酸缓冲液200 μL（pH＝8.9）配制的0.01 mmol／L 的ThT 混匀显色，采用荧光酶标仪，在激发光波长450 nm、发射光波长485 nm 下测量荧光强度［9］，平行3 次。

2.7 氧化应激实验 挑取处于产卵期的N2 线虫，在NGM 平板上产卵3 h。将孵出的蠕虫转移到空白组与不同浓度TSB⁃Ⅱ组，在20 ℃下培养至3 d后，转移至含有胡桃醌（0.2 mmol／L）的NGM 板上，每隔1 h 观察蠕虫存活情况1 次，直至线虫全部死亡［10⁃11］，平行3 次。

2.8 热应激实验 挑取处于产卵期的N2 线虫，在NGM 平板上产卵3 h。将产下的卵孵出的蠕虫转移到空白组与不同浓度TSB⁃Ⅱ组板上，在20 ℃培养箱中培养3 d 后升温至35 ℃，每隔1 h 观察线虫存活情况1 次，直至线虫全部死亡［12］，平行3 次。

2.9 TSB⁃Ⅱ对过氧化氢酶的影响 线虫同步化后虫卵加到NGM 板上，置于16 ℃恒温培养箱中孵化12 h，将蠕虫转移至空白组与不同浓度TSB⁃Ⅱ组板上，置于16 ℃恒温培养箱中孵化24 h 后升温至25℃孵化36 h，以诱导Aβ 基因表达。M9 缓冲液收集各组线虫于EP 管内，蛋白裂解液（1 mmol／L PMSF）冰浴超声提取线虫体内总蛋白，BCA 法对蛋白进行定量分析，按照试剂盒操作步骤进行显色，最后通过紫外酶标仪检测，计算相应数值，平行3 次。

2.10 β 淀粉样蛋白寡聚体的点印记分析 对线虫体内各给药组总蛋白进行定量分析后，计算不同浓度组蛋白含量，再确定不同浓度给药组蛋白印迹分析时的上样量，蛋白定量点样在0.22 μm NC 膜上，自然挥干后在室温下用TBST 配置的5%脱脂奶粉封闭1 h，1×TBST 于摇床上洗3 次，每次5 min，4 ℃下与一抗A11 孵育摇床振摇过夜，1×TBST 于摇床上洗3 次，将膜与过氧化物酶偶联的二抗摇床振摇孵育1 h，1×TBST 于摇床上洗3 次，膜加入显影液后放入凝胶成像仪中避光显色并拍照，曝光时间根据膜曝光程度调整至最佳状态，通过凝胶图像处理系统分析光密度值。

2.11 实时荧光定量 重复“2.10”项下步骤诱导Aβ 基因表达，加M9 缓冲液冲洗2～3 次后离心，吸取上层缓冲液，虫体放入－80 ℃冰箱中冻存数小时后，采用Trizol 法提取线虫总RNA，取3 μg至EP 管中，按照试剂盒说明书使其进行逆转录反应，得到cDNA，于－80 ℃下保存备用。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.12 统计学分析 分析方法为 Relative Quantification Study，计算方法为2－△△Ct。通 过GraphPad Prism 6.01 软件进行处理，Image J 软件分析荧光强度，重复3 次，取平均值。

3 结果

3.1 TSB⁃Ⅱ对线虫瘫痪、寿命、活性氧、氧化应激、热应激等实验的影响 如图1a 所示，相比空白组，不同浓度TSB⁃Ⅱ组均有一定的抗线虫瘫痪作用（P＜0.05），其中TSB⁃Ⅱ⁃40 组效果最佳，后期选取TSB⁃Ⅱ⁃40、TSB⁃Ⅱ⁃10、TSB⁃Ⅱ⁃2.5 组作进一步考察。如图1b 所示，不同浓度TSB⁃Ⅱ组在一定程度上也可延长线虫寿命（P＜0.05）。如图1c所示，模型组线虫体内ROS 高于不同浓度TSB⁃Ⅱ组、空白组，表明诱导Aβ基因表达后出现AD 表观症状时，线虫体内ROS 水平相比空白组是增加的；不同浓度TSB⁃Ⅱ组相比模型组，均能在一定程度上降低线虫体内ROS 产生（P＜0.01）。如图1d 所示，不同浓度TSB⁃Ⅱ组相比空白组，能延长线虫死亡时间，以TSB⁃Ⅱ⁃40 作用最好（P＜0.05）。如图1e～1f 所示，相比模型组，不同浓度TSB⁃Ⅱ组均能减弱线虫受到的热应激损伤作用（P＜0.05），但对转基因线虫体内过氧化氢酶无明显影响（P＞0.05）。TSB⁃Ⅱ对线虫瘫痪、寿命、氧化应激与热应激实验的影响见表2。

表2 TSB⁃Ⅱ数据秩和检验Tab.2 Kruskal⁃Wallis tests for TSB⁃Ⅱdata

3.2 TSB⁃Ⅱ对Aβ 体外聚集的影响 如图2 所示，相比空白组，不同浓度TSB⁃Ⅱ组均能在一定程度上降低β 淀粉样蛋白的聚集（P＜0.01）。

图2 TSB⁃Ⅱ对Aβ 体外聚集的影响（， n＝3）Fig.2 Effect of TSB⁃Ⅱon the in vitro aggregation of Aβ（， n＝3）

3.3 TSB⁃Ⅱ对Aβ 体内聚集的影响 如图3 所示，升温诱导的线虫灰度值最高；相比模型组，不同浓度TSB⁃Ⅱ组均能降低线虫体内Aβ 聚集和沉积（P＜0.01）。

图3 TSB⁃Ⅱ对Aβ 体内聚集的影响（， n＝3）Fig.3 Effect of TSB⁃Ⅱon the in vivo aggregation of Aβ（， n＝3）

3.4 TSB⁃Ⅱ对AD 相关基因表达的影响 如图4所示，相比模型组，TSB⁃Ⅱ⁃40 组可上调sod⁃3、hsp⁃16.2、daf⁃16 mRNA 表达，下调skn⁃1、amy⁃1 mRNA 表达（P＜0.05，P＜0.01），而TSB⁃Ⅱ⁃2.5组sod⁃3 mRNA 表 达，TSB⁃Ⅱ⁃10、TSB⁃Ⅱ⁃2.5 组daf⁃16 mRNA 表达无明显变化（P＞0.05）。

图4 TSB⁃Ⅱ对AD 相关基因表达的影响（， n＝3）Fig.4 Effects of TSB⁃Ⅱon the expressions of AD⁃related genes（， n＝3）

4 讨论

AD 的治疗与治愈是近年来研究的热点，其主要病理学特征为大脑皮质萎缩和Aβ 沉积形成的老年斑，表现为渐进性记忆减退、认知功能障碍。但其发病机制并未完全阐明，目前国内外公认的学说有Aβ 沉积学说。Aβ 是由一个跨膜糖蛋白淀粉样前体蛋白（APP）经β 和γ 分泌酶水解产生的一段中间肽链。有研究证明，Aβ 的过度产生以及促进Aβ 的聚集和沉积或抑制Aβ 沉积物的清除是导致阿尔茨海默病的主要原因之一。正常情况下Aβ的产生和消除处于动态平衡，当体内平衡遭到破坏时易引起Aβ 的沉淀和聚集，进而激发炎症级联反应，产生氧化应激作用于线粒体，影响能量代谢，加速Tau 蛋白磷酸化，神经纤维缠结的形成和降低兴奋性阈值等途径发挥神经毒性，因此调控Aβ 的形成与代谢对于AD 的预防和治疗具有重要作用。SOD 作为常见抗氧化酶之一，能一定程度抵御氧化应激与清除体内活性氧。胰岛素信号通路是重要的寿命调节通路，daf⁃16 mRNA 是调节衰老的下游组件，其大量表达能够延缓衰老，延长线虫寿命，sod⁃3 作为daf⁃16 的靶基因，可通过催化的去除保护机体免受氧化应激。小分子热休克蛋白hsp⁃16.2 是一种低分子量多肽，存在大部分机体中，该基因的表达可促进细胞对新生Aβ 蛋白的清除从而减缓Aβ 蛋白的毒性。skn⁃1 mRNA 是与氧化诱导反应的转录因子，基因的表达可以调控抗氧化应激反应，一定程度上延缓氧化损伤。amy⁃1 mRNA可能协调参与升温诱导后A 温基因的表达导致的瘫痪。

本研究以秀丽隐杆线虫CL4176 为模型，探讨了不同浓度TSB⁃Ⅱ对线虫瘫痪、寿命、活性氧、氧化损伤及热应激损伤和Aβ 的产生、聚集等方面的影响，结果表明TSB⁃Ⅱ不同浓度给药组均能一定程度上抗线虫瘫痪、延长线虫寿命、降低活性氧、减轻氧化损伤及热应激损伤。通过药物与Aβ1－42蛋白单体共孵育，发现药物不同浓度组均能一定程度上降低Aβ 的体外聚集。通过Aβ 寡聚体的点印记分析、实时荧光定量PCR 分析发现TSB⁃Ⅱ可上调线虫体内sod⁃3、hsp⁃16.2、daf⁃16 mRNA的表达和下调skn⁃1 和amy⁃1 mRNA 的表达，由此可知TSB⁃Ⅱ能够增强秀丽隐杆线虫CL4176 对于氧化应激和热应激的耐受性，降低Aβ 蛋白的聚集和沉积，具有保护神经元的作用，其对Aβ 的产生、聚集的抑制作用可能与寿命胰岛素信号通路相关。