葛根芩连汤单味提取物组方与传统汤剂功效成分一致性研究

廖嘉宝 胡艳楠 魏小涵 夏 婷 阮世发 王丽丽 谭晓梅#

1 华润三九医药股份有限公司 广东 广州 518110

2 南方医科大学中医药学院广东省中药制剂重点实验室 广东 广州 510515

3 合肥华润三九医药有限公司 安徽 合肥 230041

本研究拟通过建立高效液相色谱法（HPLC）单一色谱条件，同时测定葛根芩连汤中四味药的葛根素、大豆苷、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷和甘草酸铵7种成分含量的方法，探究以传统汤剂或单味提取物合并的用药方式对葛根芩连汤溶液及其沉淀中有效成分的影响。此外，建立HPLC指纹图谱比较的方法，研究单味提取物合并液与传统煎剂的溶液及其沉淀的指纹图谱的差异，阐述葛根芩连汤单味提取物组方用药的合理性，为葛根芩连汤相关制剂及其单味提取物组方用药方式的质量评价及临床科学使用提供参考。

1 材料

Agilent1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Agilent1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；真空冷冻干燥仪（德国LABCONCO公司）；万分之一天平（德国Sartorius）；十万分之一天平（德国Sartorius）。葛根芩连汤饮片组成：葛根、黄连、黄芩、炙甘草饮片各10批，分别制备单味提取物及传统煎剂样品，单味提取物合并组方所用饮片和合煎样品相同。对照品均购自中国食品药品检定研究院。

2 含量测定方法与结果

2.1 样品的制备：分述如下。

2.1.1 葛根芩连汤传统汤剂样品制备：称取葛根30g，黄连、黄芩各18g，炙甘草12g，葛根加水浸泡，先煎20min后加入余下3味煎煮，过滤后，药渣加水2次煎煮，取滤液，合并水煎液，浓缩干燥，得传统汤剂的冻干粉样品（批号H1-10）。同法煎煮葛根芩连水煎液，离心，得10批传统汤剂的沉淀样品（批号HS1-10）。

2.1.2 葛根芩连汤单味提取物合并液样品制备：称取葛根加水浸泡，煎煮2次，合并水煎液；分别称黄连、黄芩、甘草，水煎煮2次，分别得黄连、黄芩、甘草的水煎液。水煎液浓缩干燥，分别制得单味提取物合并液的冻干粉样品（批号D1-10）。同法煎煮葛根芩连汤单味提取物，离心，得10批单煎合并沉淀样品（批号DS1-10）。

2.2 含量测定色谱条件：以C18为色谱柱，柱温25℃；以甲醇（A）-0.15%三氟乙酸（B）为流动相进行梯度洗脱，条件为 0～20min，23%～30%A；21～34min，35%～40%A；35～45min，42%～45%A；50～54min，60%～80%A；54～60min，80%～80%A；流速为 1.0ml/min；检测波长250nm；进样量为5μl。

2.3 混合对照品储备溶液的制备：精密称取葛根素、大豆苷、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷和甘草酸铵对照品适量，加80%甲醇制成混合对照品溶液。

2.4 含量测定供试品溶液的制备：取冻干粉约0.15g，或沉淀物0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，称定质量，超声处理，用80%甲醇补足减失质量，摇匀，离心取上清，滤过即得供试品溶液。

2.5 含量测定方法学考察：按方法学考察要求开展专属性、线性关系、精密度、重复性、加样回收及稳定性试验，均符合要求，见图1A-H。说明该方法用于分析葛根芩连汤样品含量测定准确稳定。

图1 含量测定方法学考察结果

2.6 葛根芩连汤单味提取物合并液与传统汤剂含量分析：按2.1项下的色谱条件进行测定，记录色谱图（图2A），结果显示在溶液中，相比于传统合煎液，10批单煎合并液中葛根素的含量平均高113%，大豆苷平均高114%，盐酸小檗碱平均高141%，盐酸巴马汀平均高129%，黄芩苷平均高119%，汉黄芩苷平均高116%，甘草酸铵平均高145%，差异具有统计学意义（图2B）。

2.7 葛根芩连汤单味提取物合并液与传统汤剂中的沉淀物分析：按2.1项下的色谱条件测定，记录色谱图（图2C）。相比于传统合煎沉淀，10批单味提取物合并液沉淀中葛根素的含量平均低13%，大豆苷平均低10%，盐酸小檗碱平均低17%，盐酸巴马汀平均低16%，黄芩苷平均低17%，汉黄芩苷平均低13%，甘草酸铵平均低11%，差异具有统计学意义（图2D）。

3 指纹图谱方法与结果

3.1 指纹图谱色谱条件：以C18为色谱柱；以0.1%磷酸溶液(A)-乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱，条件为0～40min，90%～60%A；40～45min，60%～55%A；波长为275nm，柱温为25℃。

3.2 指纹图谱对照品溶液制备：取3-OH葛根素、葛根素、大豆苷、甘草苷、染料木苷、药根碱、黄芩苷（S峰）、巴马汀、小檗碱、汉黄芩苷、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加80%甲醇制对照品参照物溶液。

3.3 系统方法学考察：按系统方法学要求进行试验，精密度、重复性和稳定性中16个特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD%小于3.0%，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012版软件进行数据处理，相似度均在0.999以上。说明该方法用于分析葛根芩连汤样品指纹图谱准确稳定。

3.4 葛根芩连汤单味提取物合并液与传统汤剂指纹图谱比较：按3.2项下的色谱条件进行测定，记录色谱图，供试品色谱中应呈现16个特征峰，其中1、2、5、6、7、9、11、12、13、15、16号峰的保留时间应分别与3OH-葛根素、葛根素、大豆苷、甘草苷、染料木苷、药根碱、黄芩苷、巴马汀、小檗碱、汉黄芩苷、甘草酸铵对照品参照物峰的保留时间相对应；以黄芩苷参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8%之内，规定值为0.32(峰1)、0.42(峰 2)、0.43(峰3)、0.44(峰4)、0.54(峰 5)、0.69(峰 6)、0.73(峰 7)、0.88(峰 8)、0.89(峰 9)、0.91(峰10)、1.00(峰11，黄芩苷，S峰)、1.03(峰 12)、1.06(峰13)、1.14(峰14)、1.21(峰15)、1.55(峰16)。按中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统计算葛根芩连汤单味提取物合并液（图3B）、传统汤剂的冻干粉对照指纹图谱（图3A）的多批供试品指纹图谱相似度达0.999，表明该方法能用于葛根芩连汤水煎液样品的指纹图谱鉴别分析。

按中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统计算生成10批葛根芩连汤单味提取物合并液、传统汤液的冻干粉的对照指纹图谱并进行比较（图3C），设传统合汤液的指纹图谱为对照图谱，结果显示两者指纹图谱相似度高达0.999，表明葛根芩连汤应用不同煎煮方式入药对其水煎液的物质组成类型无显著差异，但峰面积差异明显。

3.5 葛根芩连汤传统汤剂沉淀与单味提取物合并液沉淀的比较：按3.2项下的色谱条件进行测定，记录色谱图。按中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统计算，并生成10批单味提取物合并液沉淀（图3D）和10批传统汤剂沉淀对照指纹图谱（图3E）。结果显示，10批葛根芩连汤单味提取物合并液沉淀和10批传统汤剂沉淀供试品相对保留时间及相似度均在要求范围内。将10批葛根芩连汤传统汤剂液沉淀与单味提取物合并液沉淀样品各自生成的特征指纹图谱进行比较（图3F），相似度为1.000，10批葛根芩连汤传统汤剂液沉淀与单味提取物合并液沉淀样品共有峰的出峰时间一致，指纹图谱相似，但是峰面积相差较大。

图3 葛根芩连汤水煎液冻干粉与沉淀物指纹图谱

4 讨论

本研究同时测定葛根芩连汤中4味药的7种有效成分含量，成分类别包括异黄酮、黄酮、生物碱和皂苷类，有效成分具有代表性，方法简单便捷，可用于评价不同工艺对其主要化学成分的影响。所建立的指纹图谱分析方法能准确标识葛根芩连汤中16个共有峰，明确了其物质基础组成特征。

传统饮片的煎煮由于个人习惯、火候掌握等客观因素的影响，含量差异较大，而单味提取物煎煮工艺及含量相对稳定，使用方便，含量较高。有学者从中药单味提取物研究入手，对中药单煎与合煎的对比发现，造成二者成分差异的机制可能与助溶效应、沉淀效应、改变溶剂溶解特性、改变溶液pH值、相互反应生成溶解度不同的新成分有关，其影响因素包括药物不同配比、煎煮时间、加水量与药物的比例及炮制对中药成分溶出率的作用、单煎液混合时的相互反应等。

对10批葛根芩连汤单味提取物合并液与传统汤剂的指纹图谱研究，对于标定的16个特征色谱峰，其相对保留时间在要求范围内，溶液之间的相似度为0.999，沉淀之间的相似度为1.000，两者的色谱图基本一致，单味提取物合并液仍能保留传统汤剂的化学特性及沉淀特征。单味提取物合并液的7种药效成分含量均高于传统汤剂，表明在葛根芩连汤的复方中单味药材煎煮的方式较传统汤剂更有利于有效成分的溶出，避免了煎煮过程中各要药味成分的相互作用。研究还发现，由于药味中的化学成分的酸碱特征，葛根芩连汤传统汤剂与单味提取物合并液放冷后均有浅黄色絮状沉淀生成，沉淀重量之间无明显差异，但单味提取物合并液沉淀中7个有效成分含量小于传统汤剂沉淀，约为传统汤剂沉淀的8%～20%，传统合煎工艺可能导致指标成分更多地从上清液转移到沉淀，单煎合并的煎煮方式能有效减少有效成分在沉淀中的分布，使其更多地留存在上清液中。已有研究表明，沉淀产生的原因可能是葛根中呈酸性的异黄酮类成分与黄连中呈碱性的生物碱成分相互反应，形成络合物进而沉淀有关，传统合煎成分相互作用时间长，沉淀中的有效成分多于单煎合并液。而从沉淀物的指纹图谱及特征图谱分析结果看，葛根芩连汤沉淀中同样存在着一定量的活性成分。本研究显示单味提取物组方入药的方式减少了有效成分往沉淀物中转移，提高了药液中有效成分含量，有利于活性成分快速吸收。

临床上，中药复方用药形式多样，与传统的煎煮方式相比，以单味提取物组方形式入药的中药配方颗粒常受到质疑，而依据中医辨证、君臣佐使配伍用药为中医方剂的根本要义，中药配方颗粒组方用药并不违背配伍组方原则。此外，单味提取物组方入药备受争议的另一因素是传统煎剂中共煎产生新的化学物质，而本指纹图谱结果研究表明葛根芩连方通过单味药煎煮后以提取物合并组方与传统煎剂的有效物质相似度高，反映出葛根芩连汤中药配方颗粒组方与传统煎剂的物质组成的一致性。研究还表明葛根芩连汤单味提取物组方能减少有效成分往沉淀中转移，利于葛根芩连汤功效成分体内快速吸收。本研究为葛根芩连汤各药味的单味提取物组方用法提供了临床应用参考，还为葛根芩连方其配方颗粒制剂研究提供了工艺指导。