有氧运动及节食干预对高脂诱导肥胖大鼠鸢尾素水平的影响

2021-09-27陈甜甜李宁川王鸿伟

杭州师范大学学报(自然科学版) 2021年5期

陈甜甜，李宁川，王鸿伟，何柳

(扬州大学体育学院，江苏扬州 225127)

0 引言

肥胖症是脂肪组织发生慢性炎症所引发的相关代谢疾病，随着世界各地经济水平的迅猛发展，人们生活质量及生活方式明显改变，而肥胖症的发病率高、增长态势也越发明显，肥胖是大部分代谢类慢性病的通用促病因素[1].目前对于肥胖干预比较公认的手段主要通过运动耗能与能量摄入限制等方式[2-3].已有证实坚持以植物为主的膳食模式和减少能量摄入可有效改善体脂量，但此种方式所引起的反弹及胃肠道反应等副作用一直以来备受争议，节食的度量把控及相关因子的影响研究并不完善.运动减脂机理是以直接消耗身体脂肪，增加肌肉比重，提高基础代谢为目的[4].一直以来脂代谢与运动强度之间的关系一直是研究的热点，不同运动形式的效果不同，但其中最为公认和普及的依然是中等强度有氧运动.鸢尾素(Irisin)作为一种肌肉因子，分泌水平受运动决定，自发现以来备受关注.研究发现鸢尾素可以促进白色脂肪转化为棕色脂肪[4-5]，在肥胖、糖尿病等代谢类疾病上的良效不断得到证明[6].但Irisin影响条件多，运动与Irisin关系复杂，运动强度对鸢尾素分泌的影响仍然不确定.节食对于BAT及Irisin的水平是否有影响，与运动相比节食是否有其他副作用，节食与普及度最高的中等强度有氧运动相比干预效果与维持效果哪一个更优，这些问题都有待解决.本研究结合已有研究基础通过对高脂诱导的肥胖大鼠进行长时中等强度的有氧运动与节食干预，假设两种减脂方式对肥胖均有较好改善，运动减脂效果及维持度可能更好，运动对BAT及Irisin的水平有较大影响，而节食干预无影响，并结合研究实践进一步探究.

1 材料与方法

1.1 实验对象及实施方案

3周龄雄性SD大鼠50只( 江苏大学提供)，体质量90～100 g，随机分为两组：普通对照组(NC，n=10)、高脂造模组(n=40).普通对照组(NC组)每天普通饲料喂养，高脂造模组每天高脂饲料喂养.高脂膳食配方：高脂饲料由普通饲料52.2%，蔗糖20%，猪油15%，胆固醇1.2%，胆酸钠0.2%，酪蛋白10%，磷酸氢钙0.6%，石粉0.4%，预混料0.4%，由江苏协同生物有限公司加工，高脂饲料供能比：蛋白质17.5%、脂肪37%、碳水化合物45.5%，总能量为25.17 kJ/g.经6周高脂膳食后统计高脂造模组体质量与Lee’s指数，将超过对照组平均体质量20%且Lee’s指数呈显著性差异的大鼠随机分为高脂对照组(HF组)、高脂运动组(HE组)、节食组(DR组).节食组(DR组)不运动，第一周自由饮食高脂饲料并记录一周饮食量，第二周按照第一周平均日饮食量的80%喂养，第三至第八周按照第一周平均日饮食量的70%喂养[6]；HE组采用无负重游泳，开始适应性游泳一周，之后渐增加游泳时长，每天10 min递增至60 min后每周进行6 d 60 min无负重游泳，周日休息共持续8周.游泳方案采用改进的唐东辉[6]游泳训练方案.干预过程中NC组继续以普通饲料喂养，高脂组(HF、HE、DR组)继续以高脂饲料喂养.

1.2 取材

各组大鼠于末次游泳结束后称重，禁食12 h正常饮水，大鼠麻醉后于腹主动脉取血10 ml，制备血清保存于-20 ℃冰箱；取睾周、肾周脂肪垫及肩胛骨处棕色脂肪及腓肠肌称重，保存于-80 ℃冰箱.

1.3 检测指标与方法

1.3.1 形态学指标测定

(2)体脂率:取材时取出睾、肾周脂生理盐水冲洗后用滤纸吸干称重，体脂率=(睾周脂+肾周脂)/体质量.

(3)棕色脂肪率:取肩胛骨处棕色脂肪生理盐水冲洗后用滤纸吸干称重，棕色脂肪率=(肩胛骨处棕色脂肪)/体质量.

1.3.2 血清指标及脂肪、肌肉组织鸢尾素mRNA表达测定

本实验干预方式为无负重游泳，脂肪干预效果中睾周脂接近体外，游泳干预效果更加明显，因此大鼠中脂肪与肌肉分别选取睾周脂与腓肠肌进行测定.

1.3.2.1 血清相关生化指标测定

采用DXC-800全自动生化分析仪测定血清中甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量；酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中鸢尾素水平(试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司)，所用仪器为Multiskan Co标准规格全波长酶标仪.

1.3.2.2 大鼠睾周脂及腓肠肌mRNA表达测定

(1)引物设计:从中国知网数据库中获得鸢尾素前体物FNDC5基因序列，利用DNAMAN软件设计上、下游特异性引物，-CGTAACCGTCAGGCACTCAAG，-CGCAGCATCTCACATCCTTCTTC；扩增长度210 dp，由上海生物工程有限公司合成纯化并用无菌去离子水配制，使用液浓度为10 pmol/μl.为了准确检测表达水平，选用β-肌动蛋白(β-actin)表达量作为内参对照.β-actin f5’-TCTCCTT CTGCATCCTGTCA，r5’-GCTGAGAGGGAAATCGTGCG，产物长度422 bp.

(2)总RNA提取:Trizol一步法分别提取大鼠睾周脂及腓肠肌中的总RNA，使用紫外分光光度计(日本岛津公司UV-2450型)测定总RNA浓度和纯度，OD260/OD280比值在1.7～2.0之间.

(3)逆转录:逆转录反应按照北京聚合美生物科技有限公司提供的逆转录试剂盒说明书进行.反应条件：miRNA加Poly尾的反应液37 ℃孵育15 min后，立刻进行第一链cDNA的合成，85 ℃孵育5 min.将逆转录合成的cDNA直接进入荧光定量检测.

(4)实时荧光定量PCR：①室温融化2×miRNAqPCR Mixture和Reverse Primer.②将2×miRNAqPCR Mixture均匀混合，并短暂离心后使用.③将试剂置于冰上配制反应体系，见表1.

表1 qPCR荧光定量反应体系Tab.1 qPCR fluorescence quantitative reaction system

PCR条件控制：Stage 1：95 ℃，10 min，40—50cycles； Stage 2：95 ℃，15 s； Stage3:60 ℃，1 min.溶解曲线分析：根据PCR仪要求.

(5)PCR产物定量分析:荧光定量数据先采用2-ΔΔCt，2-ΔΔCt 法计算公式：ΔΔCT=(待测组目的基因平均CT值-待测组内参基因平均CT值)-(对照组目的基因平均CT值-对照组内参基因平均CT值).计算统计后再用SPSS 20.0软件进行处理.

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 SD大鼠6周造模前后体质量、Lee’s指数变化

造模之前各组SD大鼠体质量和Lee’s指数均无显著性差异，造模6周后高脂膳食组大鼠体质量相比对照组具有极显著性差异(P<0.01)；造模后高脂组Lee`s指数相比普通组较高并具有极显著性差异(P<0.01)，统计超过普通对照组平均体质量20%的大鼠共有36只，见表2.为保证实验变量的控制，从36只造模成功的大鼠中随机选取30只进行干预实验.

普通对照组与高脂膳食组2*2重复测量方差分析比较，P<0.05用*表示；P<0.01用**表示.

2.2 SD大鼠8周干预后能量摄入量

将4组SD大鼠中NC、HF、HE组充足饲料喂养并记录投食饲料量，24 h后统计剩余饲料量，前后相减得出每日大鼠摄食量，DR组根据限食要求控制投食饲料量.根据普通饲料16.7 kJ/g、高脂饲料25.17 kJ/g计算平均每日每只大鼠能量摄入量.结果发现,与NC组相比，在干预第一周HE、HF、DR组大鼠能量摄入量远高于对照组并存在显著性差异(P<0.01)，到第八周HF组能量摄入量增加且存在显著性差异(P<0.01)，HE组能量摄入下降与NC组无显著性差异，DR组下降明显存在显著性差异(P<0.01).与HF组相比，HE组第一周能量摄入量下降并存在显著性差异(P<0.01)，DR组第一周无显著性差异；8周干预后HE、DR组能量摄入下降明显与HF组存在显著性差异(P<0.01).8周干预过程中NC组、HF组能量摄入量先增加后下降并趋于稳定，HE组能量摄入量先下降后增加并趋于稳定，DR组进行能量摄入限制，摄入量基本不变，见表3.

表3 平均每日每只大鼠能量摄入量Tab.3 Average daily energy intake of each rat /kJ

2.3 干预后各组SD大鼠体质量、体脂率、棕色脂肪率的变化

8周实验结束后与NC组相比，HF、HE组大鼠体质量增长存在显著性差异(P<0.01)，其中HF组体质量增加更加明显，DR组无显著差异；DR组体脂率相比NC组显著下降(P<0.01)，HE、HF组体脂率有所增加，但无显著性差异；HE组棕色脂肪率相比NC组显著升高(P<0.01)，HF、DR组无显著差异.

与HF组相比，HE、DR组体质量显著下降(P<0.01)；HE组体脂率显著下降(P<0.05)，DR组体脂率极显著性下降(P<0.01)；HE组棕色脂肪率出现极显著性增加(P<0.01)，DR组棕色脂肪率出现显著性下降(P<0.05).

HE与DR组相比，HE组棕色脂肪率显著升高(P<0.05)，见表4.

表4 干预后各组大鼠体质量、体脂率、棕色脂肪率Tab.4 Body weight, body fat rate and brown fat rate of rats in each group after intervention

2.4 8周干预后SD大鼠血清TG、TC、HDL、LDL、鸢尾素含量变化

与NC组相比，HF组大鼠血清中的TG、鸢尾素水平明显升高，HDL显著下降(P<0.01)，TC、LDL水平升高无显著性差异；有氧运动与节食干预后均可降低高脂膳食大鼠血清中的TG、TC、LDL水平，对HDL无显著影响；HE组鸢尾素含量显著上升，DR组显著下降(P<0.05).

与HF组相比，HE组血清中TC、TG、HDL存在显著性差异(P<0.05)，鸢尾素水平无明显变化；DR组血清中TC、TG水平下降(P<0.05)，LDL、鸢尾素水平显著下降(P<0.01)，HDL显著上升(P<0.01).

HE与DR相比HE组血清中HDL、LDL存在非常显著性差异(P<0.01)，HDL显著降低，LDL显著升高；鸢尾素水平显著上升(P<0.05)，见表5.

表5 血清TG、TC、HDL、LDL、鸢尾素含量Tab.5 Contents of serum TG, TC, HDL, LDL and iritigenin / (mmol / L)

2.5 睾周脂与腓肠肌中鸢尾素mRNA表达

与NC组相比，高脂膳食后HF、HE组睾周脂和腓肠肌中鸢尾素表达量均有所增加，HE组腓肠肌和睾周脂中鸢尾素表达量均显著性增加(P<0.01)；DR组中的鸢尾素表达水平与NC组无显著差异.

与HF组相比，HE组中睾周脂与腓肠肌中鸢尾素表达均存在显著性差异(P<0.01)，DR组无明显差异.

HE与DR相比HE组腓肠肌和睾周脂中鸢尾素表达量均显著性增加(P<0.01)，见表6及表7.

表6 SD大鼠睾周脂中鸢尾素mRNA表达Tab.6 Expression of iridoin mRNA in peritesticular fat of SD rats

表7 SD大鼠腓肠肌中鸢尾素mRNA表达Tab.7 Expression of irisin mRNA in gastrocnemius muscle of SD rats

2.6 血清中鸢尾素含量与棕色脂肪率相关关系

由表8可知血清中的鸢尾素含量与棕色脂肪率两者之间Pearson相关系数为0.307(P<0.05)，腓肠肌中的鸢尾素含量与棕色脂肪率两者之间Pearson相关系数为0.964(P<0.05)，睾周脂中的鸢尾素含量与棕色脂肪率两者之间Pearson相关系数为0.977(P<0.05)，均为显著正相关.

表8 鸢尾素含量与棕色脂肪率相关关系Tab.8 Correlatity between contents of irisin and brown fat rate

3 讨论

肥胖是由机体能量失衡所引起的一种脂质代谢紊乱的代谢疾病[8]，本实验采用高脂膳食诱导建模，该模型与人类日常高能高热饮食导致的肥胖比较接近.通过6周高脂膳食造模，大鼠体质量高于普通对照组大鼠体质量20%，高脂组TC、TG、LDL水平显著高于普饲组，同时HDL水平明显降低，这表明已成功诱导营养型肥胖大鼠，高脂肥胖大鼠造模成功.

本实验在干预的第一周，各组大鼠饮食摄入量均有所增加，推测大鼠处在长期引起摄食量的增加时期，闫凯[9]在肥胖大鼠干预初期体质量也有所增加，证实了我们的观点.高脂饲料喂养过程中大鼠对高脂饮食存在厌食行为，导致HF组摄食量有所下降；HE摄食量起伏较大，分析原因可能是运动之后能量消耗引起摄食量增加；DR组进行能量摄入限制后摄食量基本不变.相比NC组，HF、HE、DR组摄食量存在显著性差异，表明不同干预方式对大鼠能量摄入存在较大影响.

3.1 运动及节食干预对肥胖大鼠体质量及体脂率的影响

大量动物实验证明，运动可以显著降低机体的体质量及体脂，本研究通过建立肥胖大鼠模型，经过8周有氧运动干预后发现大鼠体质量下降明显，相比于HF组，HE组大鼠在经过有氧运动干预后能够显著降低肥胖大鼠的体质量和体脂含量，表明有氧运动可以提高机体热量消耗，促进脂肪的分解供能.节食属于减脂的另一种方式，可通过降低能量摄入，在能量动态平衡中出现失衡，促使机体动用脂肪供能减少脂肪含量.一般认为减少每日正常摄食量的25%左右即可达到能量摄入限制[10].刘子铭[11]等使用30%能量摄入限制模型对SD肥胖大鼠进行4周节食干预，结果表明能量摄入限制能有效降低肥胖大鼠的体质量及体脂含量.本研究肥胖大鼠8周30%节食干预后大鼠体质量、体脂及棕色脂肪率明显低于高脂对照组，与刘子铭等实验结果相符.相比HF组，DR组大鼠经过节食干预后能够显著降低肥胖大鼠的体质量和体脂含量.另外有研究显示节食降低小鼠体质量的同时可延长寿命、延缓心脏衰老、预防动脉粥样硬化等心血管疾病[12-13].且通过适度限制能量摄入能够实现减重，并且复胖几率较低[14]，因此节食与运动是目前预防及治疗肥胖的有效手段.

3.2 运动干预对肥胖大鼠鸢尾素水平影响及机制

运动过程中肌细胞内钙离子浓度升高，引起肌肉中PGC-1α表达增加[15-16]，骨骼肌中PGC-1α表达可提高FNDC5表达，继而影响FNDC5下游调控因子鸢尾素水平[17].大量研究均证实，运动可以刺激Irisin分泌，且主要通过肌肉组织分泌产生[18].脂肪组织也表达FNDC5，分泌Irisin[19]，Raschke[20]及HuhJY[21]等研究发现肌肉组织的Irisin基因表达量比脂肪高95%.本实验有氧运动干预后分别对脂肪及肌肉组织的进行Irisin水平测量，结果均发现Irisin表达，HE、HF组大鼠腓肠肌和睾周脂中鸢尾素蛋白表达显著升高.此结果与前人研究结论相符，但本研究所测量出的不同组织Irisin表达水平与Raschke[20]的测算结果明显不一致，脂肪组织的Irisin表达水平较高；考虑可能是运动强度不同，且饥饿、寒冷、高温、n-3脂肪酸等均会刺激Irisin分泌[22-25]，Byung[26]发现随着水果消费量的增加和肉类消费量的减少，鸢尾素的含量也呈上升趋势.Kyung[27]表明种族是一个独立且重要的可预测Irisin水平的因素，白种人的鸢尾素水平低于非裔美国人.关于Irisin水平环境不同、品种不同、饮食差异均会成为研究结果的重要影响因素，脂肪组织中的Irisin情况目前尚缺乏研究.

目前虽然大量文献已证实运动可以提高鸢尾素水平，但Irisin分泌受到运动类型、运动强度、运动频率、运动时间等影响.胡顺宇[28]研究发现短时大强度运动可以迅速提升Irisin水平，而长时运动无显著变化.这与本研究结果相一致，本研究采用每周6次、每次60 min无负重游泳干预方法，运动强度中等，故Irisin水平无显著性变化，但与对照组相比其血清Irisin水平呈现升高趋势.王坤[29]经综述后推测Irisin的分泌对运动强度有一定要求，长时中等强度运动可能运动强度不足无法有效刺激Irisin的产生.Kraemer[30]测量有氧跑90 min中、后即可及休息20 min后Irisin水平，发现只有运动中Irisin水平才存在显著差异，表示Irisin水平呈现一过性应激升高.本研究与以上研究现象一致.

3.3 节食干预对肥胖大鼠鸢尾素含量影响及机制

大多数实验表明，运动会使体内鸢尾素水平升高，但节食干预对鸢尾素影响研究较少.有研究发现节食干预对鸢尾素的影响与白色脂肪棕色化程度有关.VarelaRodriguez等人发现，在经过3个月节食后大鼠白色脂肪组织中FNDC5和UCP1水平明显提高[31]，说明在能量限制的应激作用下促进机体白色脂肪转化，引发能量消耗继而达到减脂的效果.有研究发现在培养基中加入20 nmol/L的FNDC5可显著提高培养基中鸢尾素浓度，FNDC5作为鸢尾素的前体说明外源性和内源性鸢尾素均可促进白色脂肪棕色化[32-33].刘子铭[11]等通过限食干预，大鼠肾周处白色脂肪中UCP1蛋白水平显著性增加，并且干预组大鼠体质量和体脂含量均明显降低，表明能量摄入限制可增加肥胖大鼠白色脂肪组织中UCP1的水平并减轻体质量.本实验通过节食干预对大鼠能量摄入进行限制，干预前后睾周脂和腓肠肌中鸢尾素表达无显著性差异，DR组大鼠相比NC组鸢尾素表达有所升高.综上所述，节食干预的减脂效果是通过增加白色脂肪中UCP1水平促进脂肪的棕色化来实现的.

3.4 运动及节食干预对肥胖大鼠棕色脂肪含量的影响

有研究发现，运动是一种增加机体产热和能量消耗的活动，与BAT产热效果相同，因此运动可能会降低BAT的活性[34]，但运动过程也会刺激BAT细胞因子释放，激活BAT增殖[35].所以目前为止运动对BAT的作用尚无定论.而本实验通过8周无负重游泳运动干预后发现大鼠的棕色脂肪率显著高于其他组，支持了运动可以刺激BAT增殖的观点，考虑不同运动处方可能对BAT作用不同，具体还需进一步探索.本研究通过运动与节食两种不同肥胖干预形式对比发现，运动后大鼠棕色脂肪率和鸢尾素水平均显著高于节食组同样也显著高于对照组，可能是有氧运动后脂肪组织中鸢尾素水平升高促进了棕色脂肪的转化.在DR组中肥胖大鼠棕色脂肪含量出现下降趋势，推测是能量限制引起总体脂肪含量下降，引起棕色脂肪含量同步下降的结果.8周干预后发现与正常高脂饲养大鼠相比，运动与节食两种方法均可以显著降低体脂，但8周干预后发现经过节食干预后大鼠的体质量及体脂率下降更为显著，随着运动周期的增加，BAT对脂肪的作用效果可能会更好.

本实验相关性分析发现腓肠肌及睾周脂中3种鸢尾素与棕色脂肪组织之间存在显著的正相关，相关性非常紧密，而血清鸢尾素与棕色脂肪相关性<0.4，有一定相关关系.Yan等[36]研究表明腹型肥胖患者的血清鸢尾素水平显著下降与腰围表现呈负相关.邓鑫磊等人[37]给肥胖小鼠注射外源性鸢尾素，发现小鼠体质量显著下降，显示鸢尾素含量与机体体脂率呈负相关.以上结果均得出血清鸢尾素含量与棕色脂肪呈正相关与体脂含量呈负相关的结论，与本实验结果不完全一致，推测可能是大鼠肥胖后白色脂肪积累过多导致鸢尾素代偿性的分泌增加作用于白色脂肪导致的，具体还需进一步证明，DR组通过减少能量摄入引起大鼠体质量下降并伴随血清鸢尾素含量下降也证实了这一点.