库仑滴定法测定盐酸表柔比星缓释片水分

张勇强，刘兰侠，朱方建，刘忠明，李玉勤，宦 娣

(蚌埠市第一人民医院，安徽 蚌埠 233000)

表柔比星属于抗生素类抗肿瘤药，抑制DNA和RNA的合成，对多种移植性肿瘤均有效。[1-2]盐酸表柔比星缓释片是一种的长效低毒的新型缓释制剂，该制剂由表柔比星和生物可降解高分子材料组成，表柔比星和辅料具有较强的引湿性，缓释片在制备、存储过程中易吸潮，影响制剂的稳定性，进而影响制剂的质量。

对于盐酸表柔比星缓释片，目前国内尚没有法定的水分测定方法。目前国内常使用的水分测定方法有卡尔费休容量法测定法，减压干燥法，烘干法、甲苯法等[3-13]。但是这些方法对于测定盐酸表柔比星缓释片水分都有其不足之处，如成本高，检测不准确等问题。考虑到制剂的检测成本以及精密性和可操作性，故有必要建立一种稳定、准确、灵敏的盐酸表柔比星缓释片水分的检测方法，用于控制本品中的水分。

1 仪器与材料

1.1 仪器设备

微量水分测定仪(山东三泵科森仪器有限公司)；旋涡混合仪(上海兰仪实业有限公司)；电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，型号XA105DU)；微量进样器：0.5μL、250μL、500μL气相尖头进样针(澳大利亚SGE公司)。

1.2 试剂及材料

N-N-二甲基甲酰胺(分析纯)(上海优试化工有限公司)；无水甲醇(分析纯)(国药化学试剂有限公司)；电量法卡尔费休试剂(电解液)[格里斯(天津)医药化学技术有限公司]。

纯化水(实验室自制)；1.5mL液相色谱进样瓶(上海雷布斯生物科技有限公司)；5A型分子筛(国药化学试剂有限公司)；盐酸表柔比星缓释片：实验室自制(批号20190302，20190504，20190809，20191012)。

2 方法和结果

2.1 配制混合溶剂

量取N-N-二甲基甲酰胺(DMF)400mL于试剂瓶中，加入无水甲醇100mL，再加入适量分子筛，混匀，加盖，密封，待用。

2.2 空白溶剂制备

根据“2.1”项下方法配制混合溶剂500mL，涡旋10min，为空白溶剂样。

2.3 供试品制备

取盐酸表柔比星缓释片约20mg，精密称定，置进样瓶中，向进样瓶加入500μL DMF、甲醇(4∶1，v/v)混合溶剂，涡旋10min，使盐酸表柔比星缓释片完全溶解，即得供试样。

2.4 仪器平衡

将“2.1中配制的混合溶剂”作为电解液用注射器(必须干净、干燥)通过密封口注入到微量水分测定仪的阳极室内，液面高度位于上下刻度线之间(约120mL)，同法向阴极室注入适量试剂，两室液面高度要保持一致。按规定组装微量水分测定仪，完成后，打开电源，开始搅拌。仪器此时为测量短路状态，分多次向阳极室注入少量纯化水，仪器从测量短路状态变为过碘状态，再多次加入少量纯化水，直到仪器工作电压曲线接近为零点，并达到水平平衡为止。

2.5 仪器标定

当仪器达到初始平衡点且比较稳定时，用0.5μL进样器精密抽取0.1μL的纯化水，点击开始，然后把纯水注入到阳极室内(针尖需插入液面以下)，蜂鸣器响，信息提示测试完毕，连续标定3次，结果需为100±3μg，RSD<3%。结果见表1。

表1 仪器标定结果

2.6 线性关系考察

精密称取8份盐酸表柔比星缓释片(批号20190302)，每份约20mg，依次置进样瓶中，编号1～8号，分别向进样瓶中精密加入DMF、甲醇(4∶1，v/v)混合溶剂500μL，再向1～8号进样瓶依次分别精密加入0μL、0.2μL、0.4μL、0.6μL、0.8μL、1.0μL、1.2μL、1.5μL纯化水作为线性标曲样品，所有样涡旋10min。依次分别精密吸取空白溶剂样、1～8号样品250μL注入阳极室进行检测。空白溶剂样检测结果见表2，线性标曲样品检测结果见表3。

表2 空白溶剂检测结果

表3 线性供试样检测结果

以表3中制剂含水量(试样理论含水量)为X轴，仪器检测(检测水量)值为Y轴作散点图，再用加权最小二乘法进行线性回归。得回归方程为Y=0.4658X+155.2720(X为制剂含水量，Y为仪器检测水量)；相关系数r=0.999 8，所以该检测方法在制剂水分0%～8%内具有较好的线性关系。

2.7 定量限

2015版《中国药典》药品质量标准分析方法验证规定量限可按照LOQ=10δ/S公式计算。式中LOQ：定量限；δ：响应值的偏差；S：标准曲线的斜率。δ可通过下列方法测得：测定空白值的标准偏差；采用标准曲线的剩余标准偏差或是截距的标准偏差来代替。由表2和回归方程相关数据得，δ=1.29 ，S=0.4658，分别代入计算得：

LOQ=10δ/S=10×1.29/0.465 8=27.7(μg)

考虑到盐酸表柔比星缓释片中含水量较少，且供试溶液中含水量越少越容易受到环境影响，我们将定量限LOQ定为100μg。

2.8 重复性考察

精密称取盐酸表柔比星缓释片(批号20190302)5份，每份约20mg，分别置于各进样瓶中，编号1～5号，每只进样瓶分别精密加入500μL DMF、甲醇(4∶1，v/v)混合溶剂，涡旋溶解10min。用空白溶液或供试液润洗250μL微量进样器，分别精密吸取250μL注入阳极室进行检测，检测结果见表4。

表4 盐酸表柔比星缓释片精密度检测结果

表4实验数据显示：盐酸表柔比星缓释片精密度检测平均水分为0.60%，RSD为1.91%。精密度符合要求。

2.9 准确度考察

精密称取盐酸表柔比星缓释片(批号20190302)18份，每份约20mg，编号1～18号，分别置于各进样瓶中，每只进样瓶分别精密加入500μL DMF、甲醇(4∶1，v/v)混合溶剂，1～6号为低水分样，分别向7～12号进样瓶中精密加入0.4μL(400μg)纯化水，为中水分样；再分别向13～18号进样瓶中精密加入0.7μL(700μg)纯化水，为高水分样。涡旋混匀后，再向4～6号进样瓶中精密加入0.2μL(200μg)纯化水，为低水分加标样；向10～12号进样瓶中分别精密加入0.5μL(500μg)纯化水，为中水分加标样，再分别向16～18号进样瓶中精密加入0.8μL(800μg)纯化水，为高水分加标样，将所有样品涡旋3min。另取3个1.5mL进样瓶，分别精密加入500mL混合溶剂，涡旋3min，为空白溶剂样。用空白溶液或供试液润洗250μL微量进样器，分别精密吸取250μL注入阳极室检测，空白溶剂样、1～18号供试样依次检测。检测结果见表5和表6。

表5 盐酸表柔比星缓释片准确度未加标样检测结果

表6 盐酸表柔比星缓释片加样回收率检测结果

实验数据显示：盐酸表柔比星缓释片低、中、高样品平均回收率分别为102.80%、98.50%和98.40%，检测结果均符合要求。

2.10 结果

分别对20190504、20190809和20191012批次盐酸表柔比星缓释片按照“2.2供试品制备方法”进行制备，每批平行样3份。制备好后，分别精密吸取相应的供试品250μL注入阳极室进行检测。3批盐酸表柔比星缓释片水分测定结果见表7。

表7 三批制剂测定结果

3 讨论

3.1 方法的选择

参考2015版《中国药典》，盐酸表柔比星原料药的水分测定的方法选择的是卡尔费休容量法[13]；在前期试验中发现，我们选择卡氏容量法进行检测，测得3批盐酸表柔比星缓释片水分含量分别为0.61%，0.61%，0.58%，RSD分别为2.46%，1.95%，2.56%(n=3)；这两种方法检测的结果相差不大。但是容量法每次检测需要消耗10g左右的制剂，由于表柔比星为贵重药品，价格昂贵，这种方法检测成本较高。而对于水分测定的其他方法，如减压干燥法、烘干法、甲苯法等，考虑到其灵敏度、准确度以及适应性，并不适合用于盐酸表柔比星缓释片的水分含量的测定。所以我们需要找到一种既能准确、稳定检测缓释片中的水分，又能降低检测成本的水分测定方法。卡氏库伦滴定法主要用于测定含微量水分(0.000 1%～0.1%)的供试品，特别适用于测定化学惰性物质如烃类、醇类和酯类中的水分[15-16]。卡氏库仑法在一次检测中可以只需要消耗200mg制剂消耗量，大大降低了检测成本，但又不影响检测结果的准确度和精密度，非常适合作为盐酸表柔比星缓释片的水分检测方法。

3.2 检测的专属性

卡氏库仑法可适用多种有机和无机物中的水分测定，但由于各种化合物性质存在的差异，只有在卡氏试剂中无副反应无干扰的情况下，卡氏库仑法测定才是一种专属性的方法。其检测的原则是：1.副反应不能生成水；2.样品也不能消耗碘或释放碘。在检测中主要引起副反应和产生干扰的物质有：1.盐、氢氧化物和氧化物；2.酮和醛；3.强酸；4.硅烷醇/硅氧烷；5.含硼化合物；6.金属过氧化物；7.消耗碘的物质，如铁盐、铜盐、亚硝酸盐、硫代硫酸盐；8.强氧化剂。而盐酸表柔比星缓释片中的原料药盐酸表柔比星以及辅料聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)均不属于这八类物质，所以卡尔费休库伦法检测盐酸表柔比星缓释片中水分具有较强的专属，可用于制剂水分的测定。

3.3 溶剂的选择

溶解溶剂应选择实验常用有机溶剂，水分测定一般都使用无水甲醇作为溶剂。表柔比星原料药以及辅料聚乙烯吡咯烷酮(PVP)在甲醇中具有较大的溶解度，但辅料PLGA不溶于甲醇，实验发现PLGA在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中有较好的溶解度。通过盐酸表柔比星缓释片在无水甲醇和DMF中溶解性实验发现：先用甲醇溶解盐酸表柔比星缓释片再加入适量DMF和先用DMF溶解盐酸表柔比星缓释片再加入适量甲醇短时间内均能使溶液由浑浊变澄清。且单纯的DMF溶剂盐酸表柔比星缓释片涡旋几分钟仍不能使溶液澄清，所以选择DMF、甲醇混合溶剂溶解盐酸表柔比星缓释片。配制DMF∶甲醇为1∶4、2∶3、5∶5、3∶2、4∶1(v/v)五种不同比例的混合溶剂，分别溶解一定量盐酸表柔比星缓释片。实验发现：DMF∶甲醇=4∶1(v/v)时缓释片从破碎溶解到溶液澄清透明所需时间最短，溶解效果最好；所以选择DMF、甲醇4∶1(v/v)混合溶剂溶解盐酸表柔比星缓释片。

3.4 进样方式

盐酸表柔比星缓释片为固体制剂，可以选择固体进样或液体进样。固体进样需要将盐酸表柔比星缓释片在滴定池中溶解，但盐酸表柔比星缓释片不能完全溶解于电解液(电量法卡尔费休试剂)中，所以无法准确测量，并且加入固体制剂时需打开进样口塞，会导致大量水蒸气进入滴定池，对检测结果产生影响。只有将盐酸表柔比星缓释片先用溶剂溶解，再精密吸取一定量供试液，通过微量进样针穿刺进样口胶塞将液体加入到滴定池中。液体进样能够避免制剂不溶于电解液的困难，且可以减少进入滴定池的水蒸气，使检测结果更加准确。

3.5 称量质量及溶解时间的选择

由于盐酸表柔比星缓释片含水量较低，容易受环境影响，增大了随机误差，故我们需要称取较大的药量进行操作减小误差。我们称取3份盐酸表柔比星缓释片(20mg、30mg、40mg)分别置于3个1.5mL进样瓶中，再分别加入500μL混合溶剂，涡旋溶解观察现象。实验发现：3份盐酸表柔比星缓释片都能在500μL混合溶剂中快速崩解，涡旋1min后已基本全部溶解，涡旋10min后制剂消失，全部溶解。静置1min后，溶液均澄清透明，20mg样品无沉淀，30mg样品有少许沉淀，40mg样品有较多沉淀。所以检测时我们选择称取制剂20mg，涡旋溶解时间为10min。

4 小结

实验表明库仑滴定法测量盐酸表柔比星缓释片方法适用、稳定、可靠；水分含量在0%～8%范围内，制剂水分含量与仪器检测值呈良好的线性关系(r>0.999 8)。检测方法具有良好的准确度、精密度，并且能够有效减少检测过程中制剂的消耗，可以用于定量检测盐酸表柔比星缓释片中的水分含量。