刘氏正骨方2号对过表达Sclerostin腺病毒转染后BMSCs促成骨分化的影响

俞云飞， 王建伟， 冯 骅， 尹 恒， 华 臻， 吴 毛

(无锡市中医医院，江苏 无锡 214000)

骨折愈合是指骨折位置出现骨组织连续性修复。长骨骨折延迟愈合或不愈合的发生率高达5%～10%[1]，对患者及社会造成较为严重的负担，目前西医治疗主要包括手术、局部骨生长因子注射以及电磁波等物理治疗，虽可取得一定疗效，但存在局限性。祖国医学将骨不连其归属到“骨痿”“骨虚”范畴，认为骨不连的形成与肝、脾、肾关系密切[2]，“刘氏骨伤”作为无锡市非物质文化遗产[3]，多年来总结、完善形成的经验方——刘氏正骨方2号，临床验证效果确切[4-6]，但对其作用机制尚不明确。

近年来骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为有关骨愈合的相关研究中的明星干细胞，可在特定条件下向骨折处聚集、迁移并定向分化为骨组织细胞，被广泛应用骨不连、骨质疏松、骨与软骨组织修复等多种疾病[7]。现代研究表明[8]，多种生物信号因子及信号通路可以调控骨代谢过程，其中骨形态发生蛋白-2(BMP-2)可以通过Smad、Wnt等信号通路参与BMSCs成骨分化过程[9]。硬骨素(Sclerostin/SOST)主要表达于软骨细胞、成骨细胞等骨源性细胞[10]，早期研究被作为BMP的抑制剂，抑制BMSCs增殖和成骨方向分化的同时，还可以促进成骨细胞凋亡、降低细胞钙化沉积作用[11]。近期研究表明[12]，Sclerostin主要通过抑制Wnt信号通路激活，而非既往认为的直接抑制Smad通路参与骨代谢的调节。Wnt信号通路激活可促进成骨细胞分化，是BMSCs成骨分化的关键途径[13]。本课题组前期研究发现[10]，通过siRNA抑制Sclerostin基因可以促进BMSCs体外成骨分化过程。因此，本研究通过观察刘氏正骨方2号对BMSCs体外成骨分化过程中Sclerostin基因及Wnt信号通路的影响，探讨刘氏正骨方2号促进骨折愈合的可能作用机制，为其作为诱导剂应用于骨组织工程治疗骨不连提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物 5～6周龄清洁级SD大鼠，体质量200～250 g，雌雄比例1∶1，共30只，购自扬州大学比较医学中心，动物生产许可证号 SCXK(苏)2017-0007。本研究经无锡市中医医院伦理委员会批准(批件号 2018020)。

1.2 试剂和仪器 DMEM(货号SH30022.01，美国HyClone公司)；胎牛血清(货号12662-029，美国Gibco公司)；CCK-8试剂盒(货号ab228554，英国Abcam公司)；QuontiChrom钙分析试剂盒(美国BioAssay Systems公司)；茜素红(货号A5533，美国Sigma公司)；重组人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)(货号120-02-50，加拿大PeproTech公司)；一抗Col1A2(货号ab96723)、OCN(货号ab13420)、OPN(货号ab8448)、Sclerostin(货号ab63097)、LRP5(货号ab203201)、Runx2(货号ab23981)、β-catenin(货号ab6302)、GAPDH(货号ab9485)均购自英国Abcam公司；二抗山羊抗兔抗体(货号7074)、马抗小鼠抗体(货号7076)均购自美国CST公司；实时PCR试剂盒(货号FSQ-201，日本Toyobo公司)；反转录试剂盒(货号K1622，美国Fermentas公司)；ALP定量检测(货号P0321S)总蛋白提取试剂盒(货号P0033)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(货号P0012A)、BeyoECL Plus(货号P0018M)均由上海碧云天生物技术有限公司提供。实时PCR仪(LightCycler480，瑞士Roche公司)；NanoDrop 2000(美国Thermo&Scintific公司)；细胞计数仪、Trizol(美国Invitrogen公司)。

1.3 方法

1.3.1 含药血清制备 刘氏正骨方2号(丸剂)主要由地鳖虫2 g、血竭1 g、续断3 g、川芎1 g、没药1 g、白术1 g、熟地5 g、自然铜1 g等药材组成，均由无锡市中医医院药剂科王卿副主任中药师鉴定为正品由为无锡市中医医院药剂室统一制备，再将其分为甲组(地鳖虫2 g、血竭1 g、续断3 g、川芎1 g等)和乙组(没药1 g、白术1 g、熟地5 g、自然铜1 g等)。甲组烘干，打成细粉，混合均匀；乙组煎汤，浓缩成稠膏，将2组混合均匀，采用泛制法制成浓缩丸，成药一付约21 g，成年人临床推荐药量为1 d 2次，每次1.5 g，将其溶解、浓缩至17.5 g/L，瓶装，封盖，灭活，置于4 ℃冰箱中保存。取相同剂量的0.9%氯化钠溶液，配制对照溶液。

每只大鼠每天共给药0.07 g(约4 mL)，8点、20点分别灌服1次，连续7 d，第7天上午8点灌注全天量。给药后1 h下腹主动脉采血，经静置、离心、灭活补体、过滤除菌等步骤制备含药血清，在-20 ℃下保存备用。空白血清组大鼠给予等量生理盐水灌胃给药。

1.3.2 BMSCs分离与培养 大鼠断颈处死后消毒，剥离折断胫骨、股骨，用含双抗PBS液(青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL)冲洗出骨髓细胞，离心去上清液，PBS重悬，细胞计数，按4×105/cm2浓度将细胞均匀接种于MGM培养基上，加入10%FBS、1%双抗，置于37 ℃、5%CO2环境的恒温箱中培养，每3 d换液1次，继续培养7 d后收集细胞，取一部分用于实验，另一部分液氮冷藏保存。

1.3.3 BMSCs成骨分化诱导 将BMSCs按1×105/cm2浓度接种于6孔板，使用含MGM培养基的成骨诱导液(100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L抗坏血酸)培养24 h后，依据干预培养条件分为空白对照组(20%空白大鼠血清)、中药组(20%含药大鼠血清)、BMP-2组(50 ng/mL BMP-2)，每3 d换液1次，共培养28 d。采用CCK-8检测细胞活性，实时荧光PCR、Western Blot检测成骨分化相关分子(Col1A2、OCN、OPN)及Sclerostin mRNA、蛋白表达，ALP、茜素红染色检测细胞矿化程度。

1.3.4Sclerostin过表达重组腺病毒载体构建 NCBI数据库查询参考核苷酸序列Sclerostin(ID80722，669 bp)，采用 Primer5.0设计PCR引物，KpnⅠ、NotⅠ酶切位点添加在两边，将穿梭质粒相连接产物转化感受态 DH5α，对提取的重组穿梭质粒进行测序鉴定，将鉴定正确的重组腺病毒包装质粒命名为过表达Sclerostin[14]。收集对数期3代BMSCs，将BMSCs制成浓度为1×104/mL的悬浮液，按每孔2 000个接种于96孔板培养皿，置于37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养24 h后，使用包装好的重组腺病毒颗粒转染BMSCs(MOI=50)。为验证过表达转染效率，将处于对数生长期3代的BMSCs细胞接种于6孔培养板上，每孔1.5×105个细胞，24 h后待细胞融合为40%～50%时进行干预，分组为未使用重组腺病毒转染的BMSCs(NT组)、使用空载腺病毒颗粒转染的BMSCs(Ad-null组)、使用包装好的重组腺病毒颗粒转染BMSCs(Ad-SOST组)，3组细胞均预处理(不转染或转染)24 h后弃除原有培养基，再使用含20%FBS的普通培养基培养72 h，收集样本进行检测分析，使用实时荧光PCR、Western Blot检测Sclerostin表达效率。

1.3.5 中药血清干预过表达Sclerostin重组腺病毒载体转染BMSCs BMSCs细胞培养24 h后，分为NT组、Ad-SOST组，分别使用空载腺病毒(NT组)、过表达Sclerostin重组腺病毒转染24 h(Ad-SOST组)，再分别置换为含20%空白大鼠血清、20%含药血清干预3 d，采用CCK-8法检测细胞活性，实时荧光PCR、Western Blot检测Wnt信号通路相关分子LRP5、β-catenin、Runx2的mRNA、蛋白表达。

1.3.6 主要检测方法

1.3.6.1 CCK-8法 将BMSCs按1×107/cm2浓度接种于96孔板上，在37 ℃、5%CO2下培养24 h后进行干预，设立空白对照组，每组3个复孔，分别干预3、14、28 d后，按照CCK-8试剂盒操作步骤进行实验，酶标仪在450 nm波长处检测各孔吸光度(A)，计算细胞活性，公式为细胞活性=[(加药板A值-空白板A值)/(无加药板A值-空白板A值)]×100%。

收集细胞样品，抽取总RNA，以2 μg反转20 μL体系进行反转录以检测目的基因mRNA表达，将反转的cDNA稀释5倍，进行实时PCR，扩增体系为10.0 μL，反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 25 s扩增50个循环；溶解曲线分析95 ℃ 5 s，发现为单一峰，说明是特异性扩增；阴性对照为ddH2O，以GAPDH为内参，每个模板3个复孔，采用相对定量2-△△CT法分析，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.6.2 Western blot法 收集细胞样品，PBS清洗2次，按100∶1比例加入蛋白提取缓冲液RIPA、蛋白酶抑制剂PMSF提取蛋白，置于冰上30 min后在4 ℃、12 000 r/min下离心10 min，吸除上清，在 -20 ℃下保存。采用BCA法检测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，0.22 μm PVDF膜转膜，5%BSA封闭1 h，4 ℃一抗孵育过夜后用0.05%TBST充分洗涤，孵育二抗，常规ECL发光液显色。

1.3.6.3 茜素红、ALP染色及钙含量测定 在成骨诱导的第28天，使用固紫B试剂盒及茜素红染色法进行染色，并通过倒置显微镜观察拍照记录。按照碱性磷酸酶分析试剂盒操作步骤，进行ALP定量检测(405 nm波长处吸光度)。按照QuantiChrom钙分析试剂盒操作步骤，进行钙含量测定(584 nm波长处吸光度)。

2 结果

2.1 刘氏正骨方2号含药血清对BMSCs体外成骨分化及Sclerostin的影响 与对照组(1.033±0.092)比较，中药组(1.557±0.241)、BMP-2组(5.843±0.289)BMSCs中ALP活性增强(P<0.05)；与对照组(1.047±0.026)比较，中药组(2.047±0.315)、BMP-2组(4.883±0.694)细胞中钙沉积程度增加(P<0.05)，见图1。

注：A为ALP、茜素红染色，B为ALP活性，C为钙含量。与对照组比较，aP<0.05；与中药组比较，bP<0.05。图1 各组BSMCs细胞矿化程度

成骨诱导28 d后，与对照组[(106.1±3.7)%]比较，中药组[(145.7±19.7)%]细胞活性增强(P<0.05)，BMP-2组[(83.7±5.4)%]降低(P<0.05)；中药组、BMP-2组BMSCs成骨相关分子(Col1A2、OCN、OPN)mRNA、蛋白表达上调(P<0.05)；中药组Sclerostin mRNA、蛋白表达下调(P<0.05)，但BMP-2组SclerostinmRNA表达上调(P<0.05)。见图2。

注：A为细胞活性，B～D分别为Col1A2、OCN、OPN mRNA表达，E为Sclerostin mRNA表达，F为Col1A2、OCN、OPN、Sclerostim蛋白表达。与对照组比较，aP<0.05；与中药组比较，bP<0.05。图2 各组BSMCs中成骨相关基因与Sclerostin mRNA、蛋白表达

2.2 腺病毒转染BMSCs过表达Sclerostin与NT组[(105.2±5.5)%]比较，Ad-null组[(91.5±12.1)%]BMSCs细胞活性无明显变化(P>0.05)，而Ad-SOST组[(57.9±5.4)%]降低(P<0.05)；与NT组(1.066±0.046)比较，Ad-null组(1.048±0.054)Sclerostin mRNA、蛋白表达无明显变化(P>0.05)，而Ad-SOST组(1.719±0.202)升高(P<0.05)，见图3。

注：A为细胞活性，B为Sclerostin mRNA表达，C为Sclerostin蛋白表达。与NT组比较，*P<0.05。图3 重组腺病毒转染BMSCs后Sclerostin mRNA、蛋白表达

2.3 刘氏正骨方2号含药血清对过表达Sclerostin腺病毒转染BMSCs细胞活性的影响 与空白血清比较，培养24、72 h后含药血清可提高NT组、Ad-SOST组细胞活性(P<0.05)，见表2。

表2 血清干预后过表达Sclerostin腺病毒转染后骨髓间充质干细胞的活性

2.4 刘氏正骨方2号含药血清对过表达Sclerostin腺病毒转染BMSCs的LRP5、β-catenin、Runx2表达的影响 空白血清组中，与NT组比较，Ad-SOST组LRP5、β-catenin、Runx2表达下调(P<0.05)；含药血清干预后，NT组、Ad-SOST组三者表达上调(P<0.05)，但不能完全阻断Sclerostin过表达引起的三者表达下调(P<0.05)，见图4。

注：A～C分别为LRP5、β-catenin、Runx2 mRNA表达，D为Western Blot检测。与同组空白血清组比较，*P<0.05；与NT组同一血清比较，△P<0.05。图4 刘氏正骨方2号含药血清对过表达Sclerostin腺病毒转染BMSCs的LRP5、β-catenin、Runx2表达的影响

3 讨论

骨不连是骨科康复医疗过程中较为棘手的难题，是骨折远期严重并发症[15-16]。祖国医学认为骨不连的形成与肝、脾、肾关系密切，且以肾的强弱最为关键。肾主骨髓以养骨，骨髓为肾精所化生，骨骼的生长、发育、修复均赖肾气的滋养。我科经验方—刘氏正骨方2号以补肾活血方为基础经多代传人总结、完善形成并入选无锡市非物质文化遗产，该方中杜仲、骨碎补、自然铜入肾经，补肾壮骨，续骨止痛；土鳖虫、熟地主入肝经，土鳖虫性善走窜，能活血消肿续筋，熟地补血养阴，填精益髓；诸药合用共奏“活血祛瘀，接骨续筋、补肾养肝”之功效，临床研究表明疗效确切[4-6]，但针对其作用机制尚缺乏系统化、深层次的理论研究。

现代医学研究认为[7]，骨折愈合的关键在于成骨细胞诱导的骨组织再生与重建，而成骨细胞重要来源于干细胞的定向分化。BMSCs属于多向分化干细胞，当机体发生骨折时，细胞会趋向性迁移、聚集于骨折断端处并促成骨分化形成骨细胞，促进骨代谢及骨折愈合[8]，而骨形成是由众多生物信息网络进行调控，其中ALP、Col1A2、OCN、OPN钙结节形成是评估成骨分化程度的重要因素。基于上述中医理论及现代研究结果，课题组为探究刘氏正骨方2号对BMSCs成骨分化的影响设计实验。研究结果表明，使用含刘氏正骨方2号的含药血清可以有效提高BMSCs的细胞活性及ALP活性。同时，本研究结果中茜素红染色及成骨相关标志基因的表达情况也证实刘氏正骨方2号含药血清可以有效促进BMSCs体外成骨分化。该实验研究结果与既往活血类及续骨类药物中药可促进成骨因子诱导的成骨分化与骨代谢结果相一致[17-18]。

为探究刘氏正骨方2号诱导BMSCs介导的成骨分化作用机制，文献研究发现[19-20]，Sclerostin基因作为BMP抑制物，可以通过抑制BMP因子活性降低骨源性细胞或成骨细胞的增殖[21]。本研究结果：刘氏正骨方2号含药血清在促进BMSCs成骨分化的同时，还可以抑制Sclerostin基因的表达，提示刘氏正骨方2号促进BMSCs成骨分化可能与Sclerostin基因表达抑制有关。既往研究及我们前期研究证实[10，22]，siRNA转染沉默Sclerostin基因后可以促进BMP-4体外诱导BMSCs成骨分化及细胞矿化过程。Wnt信号通路是及其下游多种成骨相关转录因子和靶基因表达是成骨分化的关键环节[13]；Sclerostin通过与Wnt 通路中关键受体Lrp5/6竞争性结合，促进β-catenin磷酸化来抑制Wnt/β-catenin信号激活以及下游转录因子Runx2的表达，而Runx2是正向调节BMSCs促成骨分化的关键转录因子。因此，本研究采用重组腺病毒转染技术过表达BMSCs中Sclerostin基因，再使用空白血清和中药血清分别对其进行体外干预，并观察Wnt信号通路相关因子LRP5、β-catenin以及成骨相关因子Runx2的表达情况。本次实验结果显示：与空白血清比较，Ad-SOST组LRP5、β-catenin和Runx2因子表达明显下调，含药血清干预后NT组和Ad-SOST组中LRP5、β-catenin和Runx2因子表达呈现上调趋势，但含药血清不能完全阻断Sclerostin过表达引起的LRP5、β-catenin和Runx2因子下调，提示刘氏正骨方2号含药血清可以提高抑制Sclerostin过表达BMSCs的细胞活性，上调Wnt通路关键因子LRP5、β-catenin和成骨相关分子Runx-2因子的表达，但不能完全拮抗腺病毒转染的Sclerostin过表达作用，可能还存在其他影响BSMCs成骨分化的作用机制有待进一步探讨。

综上所述，刘氏正骨方2号可以促进BMSCs成骨分化，该作用可能与抑制Sclerostin基因、激活Wnt信号通路及其下游Runx2成骨转录因子表达有关。本研究从中医祛瘀、活血、补肾角度探讨刘氏正骨方2号促进骨折愈合的作用机制，为其作为诱导剂应用于骨组织工程治疗骨不连提供新的思路。