5种炮制方法对补骨脂脂溶性和挥发性成分的影响

李红伟， 曹彦刚， 田连起， 石延榜， 张振凌， 李 凯*， 冯卫生,3*

(1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.河南省中药特色炮制技术工程研究中心，河南 郑州 450046；3.呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南 郑州 450046)

补骨脂为豆科植物补骨脂PsoraleacorylifoliaLinn.的干燥成熟果实，性温，味辛、苦，归肾、脾经，具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻作用,最早见于《药性论》，首次明确了其药性和功能主治，奠定了其作为温肾助阳中药的地位[1]。通过历代中医药学家在临床不断总结和实践，对其毒性的认识也逐渐深入，如《雷公炮炙论》“性本大燥，毒”，首次创立解毒炮制工艺，《本草纲目》提出炮制解毒理论，《本草害利》进一步明确其毒性的致病机理以及禁忌症，《本草便读》认为其毒性的物质基础为“辛热香燥”等。

现代研究表明，补骨脂具有多种生物活性，但同时也具有肝、肾和细胞等毒性，且部分毒性成分又是其有效成分[1]。作为种子类和香料类药物，补骨脂具有丰富的脂溶性和挥发性成分，且临床应用常见打粉入丸散吞服。因此，研究其所含脂溶性和挥发性成分，以及炮制对这类成分的影响是十分必要的。本研究采用GC-MS法和顶空进样技术，分析补骨脂临床常用5种炮制方法对其脂溶性和挥发性成分组成和含量的影响，探讨其炮制-成分-药效-毒性之间的关联性，为临床合理用药提供参考。

1 材料

GC-2010Uira型气相色谱-质谱仪、TELEDYNE TEKMAR HT3顶空自动进样器(日本岛津公司)；N1100VWD型旋转蒸发器(上海爱朗仪器有限公司)。补骨脂(批号180301)购自亳州市张仲景中药饮片有限责任公司，经河南中医药大学董诚明教授鉴定为豆科植物补骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果实。石油醚(天津市致远化学试剂有限公司，批号202003101，500 mL，沸程30～60 ℃)；甲醇(一级色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司，批号20200507，500 mL，纯度≥99.9%)；无水硫酸钠(分析纯，批号20151202，500 g，纯度≥99.0%，北京化工厂)；正己烷(色谱纯，批号2020042003，500 mL，纯度≥97.0%，山东禹王和天下新材料有限公司)。三氟化硼甲醇络合物(上海麦克林生化科技有限公司，批号C10006531，100 mL)。精纯加碘盐(中盐长江盐化有限责任公司，批号C201912280211)；羊脂油来自绵羊；黄酒(绍兴柯桥第三酒厂，批号20191225A)。

2 方法

2.1 炮制品制备

2.1.1 清炒品 取净补骨脂，倒入炒制容器中，文火炒至膨胀、迸裂，放凉，即得。

2.1.2 雷公品 取净补骨脂，加黄酒拌匀，闷透后倾出，加入3倍量水浸72 h，滤过，置蒸锅内蒸6 h，取出，于50 ℃烘箱内干燥，放凉，即得。每100 kg净补骨脂用黄酒、水各300 kg[2]。

2.1.3 油炙品 先将羊脂油融化去渣，再加入净补骨脂，拌炒至微黄为度，即得。每100 kg净补骨脂用羊脂油10 kg。

2.1.4 盐炙品 取净补骨脂，盐炙法炒至鼓起，即得。每100 kg净补骨脂用食盐2 kg，水量为盐的4～5倍[3]。

2.1.5 盐蒸品 将补骨脂洗净，加盐水和匀，蒸1 h，即得。每100 kg净补骨脂用食盐2 kg，水量为盐量的5倍[3]。

2.2 脂溶性成分提取和衍生化处理 取生品和“2.1”项下各炮制品适量，加入20倍量石油醚，索氏回流提取法(60 ℃)提取8 h，得到脂溶性成分，计算得率，公式为y=a/b×100%，其中y为脂溶性成分得率，a为补骨脂及其炮制品分别所提取的脂溶性成分质量，b为补骨脂及其炮制品质量，炮制品折合为原药材质量。

取样品0.15 g，加入0.5 mol/L KOH甲醇溶液4 mL，65 ℃水浴皂化30 min，冷却降温后加入10%三氟化硼(BF3)甲醇溶液5 mL[8.5 mL(60%BF3)-50 mL]，65 ℃水浴2 min，冷却后分别加入正己烷、饱和NaCl水溶液各2 mL，取上清液，加无水Na2SO4干燥，滤过，进样。

2.3 挥发性成分提取 取补骨脂粉末(过40目筛)4.0 g，精密称定，置20 mL顶空瓶中密封。顶空进样条件为样品瓶加热温度120 ℃；传输线温度160 ℃；平衡时间15 min；平衡温度140 ℃；进样时间1 min。

2.4 GC-MS分析

2.4.1 GC条件

2.4.1.1 脂溶性成分 HP-FFAP型石英毛细管柱(30 m×0. 32 mm，0.25 μm)；载气高纯氦气(99.999%)；体积流量1.0 mL/min；进样口温度240 ℃；分流比100∶1；进样量1.0 μL；程序升温(80 ℃保持2 min，10 ℃/min升至190 ℃，保持2 min，2 ℃/min升至230 ℃，保持15 min)。

2.4.1.2 挥发性成分 Rxi-5MS型石英毛细管柱(30 m×0. 25 mm，0.25 μm)；载气高纯氦气(99.999%)；体积流量1.0 mL/min；程序升温(初始温度40 ℃，保持 3 min，10 ℃/min升至240 ℃，保持1 min，10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min)；进样口温度250 ℃；分流比10∶1。

2.4.2 MS条件

2.4.2.1 脂溶性成分 碰撞气氦气；离子源电子轰击源(EI源)；电子能量70 eV；扫描范围m/z30～600；检测器电压0.94 kV；离子源温度230 ℃；溶剂延迟5 min；接口温度240 ℃。

2.4.2.2 挥发性成分 碰撞气氦气；离子源电子轰击源(EI源)；电子能量70 eV；扫描范围m/z45～600；检测器电压0.88 kV；离子源温度250 ℃；溶剂延迟3.5 min；接口温度250 ℃。

2.4.3 MS检索和定量测定 质谱图用美国国家科学技术研究所的NIST 质谱库 NIST14、NIST17系统谱库自动检索，结合文献，分别与八峰索引和EPA/NIH对照，发现匹配度均在70%以上。按峰面积归一化法计算各成分相对含量，结果见表1～2。

表1 各炮制品中脂溶性成分组成和相对含量(%)

续表1

续表1

表2 各炮制品中挥发性成分组成和相对含量(%)

续表2

续表2

3 结果

3. 1 GC-MS分析 脂溶性成分总离子流图见图1，挥发性成分总离子流见图2。

图1 生品脂溶性成分总离子流图Fig.1 Total ion current chromatogram of liposoluble constituents in raw product

图2 生品挥发性成分总离子流图Fig.2 Total ion current chromatogram of volatile constituents in raw product

3.2 组成及含量分析

3.2.1 脂溶性成分 补骨脂5种炮制品得率为油炙品>盐蒸品>盐炙品>雷公品>清炒品，脂溶性成分提取率为油炙品>生品>盐炙品>雷公品>盐蒸品>清炒品，检出成分种类为油炙品>盐蒸品>清炒品>盐炙品>雷公品，鉴定成分种类为油炙品>盐蒸品>清炒品=盐炙品>雷公品，种类主要以脂肪酸和萜类(单萜和倍半萜)为主，占到检出成分种类的90.00%以上。相对于生品，所含不饱和脂肪酸的种类为油炙品>盐炙品=盐蒸品=雷公品>清炒品>生品，而相对含量为雷公品>生品>盐炙品>清炒品>盐蒸品>油炙品；所含饱和脂肪酸的种类为油炙品>雷公品>盐炙品=盐蒸品>清炒品=生品，相对含量为油炙品>盐炙品>生品>雷公品>清炒品>盐蒸品；所含萜类成分的种类为清炒品>盐蒸品>盐炙品>生品>雷公品>油炙品，相对含量为盐蒸品>清炒品>盐炙品>雷公品>生品>油炙品，见表1、3。

表3 各样品中脂溶性成分分析结果

3.2.2 挥发性成分 5种炮制方法对补骨脂中挥发性成分的种类和相对含量影响存在差异，其中检出和鉴定成分的种类均为清炒品>油炙品>盐炙品>盐蒸品>生品>雷公品，见表4；5种炮制方法均降低了脂肪族类挥发性成分的种类和相对含量，以及单萜类挥发性成分的相对含量，但清炒、盐炙和盐蒸增加了单萜类挥发性成分的种类；5种炮制方法均升高了补骨脂中倍半萜类挥发性成分的种类和相对含量，增加了芳香族类和其他类挥发性成分的相对含量，清炒、盐炙和盐蒸增加其他类挥发性成分的种类，见表2、4。

表4 各样品中挥发性成分分析结果(n=3)

4 讨论

4.1 炮制-“脂溶性和挥发性成分”-药效相关性分析 补骨脂脂溶性和挥发性成分中部分烷酸、碳烯酸和萜类等为昆虫性信息素类成分，多认为仅能够使昆虫产生性兴奋，而现有研究表明，β-石竹烯能明显提高女性唾液中睾酮的浓度，提升女性的性欲，治疗性欲减退[4-5]；(9Z,12Z,15Z)-十八碳三烯酸能够通过改善四肢微循环，治疗绝经前、围绝经期和绝经后女性所患血管舒缩症而致的恶寒症状[6]。另外，匙叶桉油烯醇具有抗细菌活性，对胸膜炎有明显的治疗作用[7]；(9Z,12Z,15Z)-十八碳三烯酸能抑制炎症和氧化应激，治疗支气管哮喘等气道炎症性疾病，低浓度给药时可以改善结肠炎的炎症损伤[8]；β-石竹烯、香叶醇可用于治疗哮喘[9-10]；茴香脑对慢性肺炎有治疗作用[11]；β-石竹烯、柠檬烯、(9Z)-十八碳烯酸可用于治疗结肠炎[12-14]；松油醇具有抗腹泻作用[15]。由此表明，脂溶性、挥发性成分可能是补骨脂具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻功效的药效物质基础。

此外，异胡薄荷醇、β-石竹烯、石竹素、香叶醇和松油醇具有镇痛作用[16-18]，十二烷酸和十四烷酸能够抑制睾酮诱导的大鼠前列腺增生，对遗尿尿频有治疗作用[19]，为补骨脂治疗腰膝冷痛、遗尿尿频提供了科学支撑。

4.2 炮制-“脂溶性和挥发性成分”-毒性相关性分析 补骨脂的诸多炮制方法皆围绕其“性本大燥，去燥毒”为炮制目的，现有研究也表明补骨脂脂溶性成分及挥发性成分有多种生物毒性，其中十六烷酸可诱导细胞凋亡，具有细胞毒性[20]；(9Z,12Z)-十八碳二烯酸能够引起机体红细胞的急性损伤，导致隐形失血，引起“伤阴”[21]；(9Z,12Z,15Z)-十八碳三烯酸高浓度时会加重结肠炎的炎症损伤[14,22]。柠檬烯、β-月桂烯具有肾毒性和细胞毒性，产生遗传毒性，有致癌和致畸风险[23]。通过炮制，以上成分含量或相对含量降低，为其炮制降低“燥毒”提供依据。

5 结论

补骨脂及其炮制品中脂溶性和挥发性成分既是其有效成分，又是其燥毒的物质基础，炮制降低脂溶性成分提取率，降低挥发性成分含量，改变成分种类和相对含量比例，以上可能是补骨脂炮制减毒增效机理之一。