miRNA-30b调控ITGB3表达促进乳腺癌细胞凋亡*

钟科 邓天芝 黄大翠

乳腺癌已成为严重威胁世界女性健康的实体恶性肿瘤。对于晚期乳腺癌，尚无有效的治疗手段[1]，肿瘤的复发以及转移是患者死亡的主要原因[2]。研究显示，非编码微小RNA（microRNA，miRNA）在肿瘤的进展中发挥促癌或抑癌的调控功能[3]。miRNA-30b是miRNA-30 家族成员之一，miRNA-30b 表达与结肠癌、前列腺癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤的进展关系密切[4]。Gao 等[5]研究显示，沉默miRNA-30b 的表达，胃癌细胞的增殖与侵袭能力明显增强。但有关miRNA-30b 在乳腺癌中的报道较少。整合素β3（integrin β3，ITGB3）是定位在胞膜上重要的跨膜蛋白受体。研究显示，ITGB3 参与调控乳腺癌细胞的增殖、迁移等生物学过程程[6]。本研究旨在通过对miRNA-30b 和ITGB3 在乳腺癌中的作用进行探讨，为乳腺癌药物的开发提供新的分子靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织样本 选择2016年3月至2019年3月144例于成都医学院第一附属医院收治的并均经病理学确诊的乳腺癌患者的组织标本，其中原位乳腺癌51例、浸润性乳腺癌48例和转移性乳腺癌45例，及癌旁组织标本144例，同时收集其临床病理资料。本研究获得本院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.1.2 细胞及动物 人乳腺癌MCF-7 细胞株购自美国典型培养物保藏中心。SPF 级雌性BALB/c 小鼠30 只，周龄5～6 周，体质量16～18 g，由本院实验动物研究中心购自成都岐黄博恩生物科技有限公司，动物使用许可证号为SYXK（川）2020-225，并获得医院动物伦理委员会批准。

1.1.3 试剂 miRNA-30b 模拟物、miRNA-NC 和过表达ITGB3（miRNA-30b 模拟物-pc）均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。GAPDH 抗体购自美国Jackson 公司；5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）试剂盒、Western blot 试剂盒均购自美国Invitrogen 公司；Transwell 小室购自美国Sigma-Aldrich 公司。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR 检测 实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测使用PCR 仪进行扩增[7]（95℃，5 s，单次循环后；95℃，5 s；60 ℃，60 s，采集荧光信号40 个循环）。各目的基因mRNA 的相对表达量采用2−△△CT表示，其中-ΔΔCt=ΔCt（标准基因）-ΔCt（目的基因）。RT-PCR 实验中miRNA-30b、ITGB3、U6 的引物序列见表1。

表1 目的基因引物序列

1.2.2 双荧光素酶实验 使用生物信息学数据库miRactDB 预测miRNA-30b 和ITGB3 存在特异性结合位点。依次构建突变和野生质粒，转染，48 h 后以PROMEGA 双荧光素酶系统进行检测。

1.2.3 细胞转染及培养 根据Tao 等[8]研究进行细胞实验分组。正常组：不加任何药物，常规培养；对照组：细胞转染的miR-NC 后，常规培养；实验组：细胞转染miRNA-30b 模拟物后，常规培养；过表达组：细胞转染的miRNA-30b 模拟物-pc，常规培养。

1.2.4 BrdU 标记实验 各组细胞培养24 h 后，10%甲醛固定并进行BrdU 实验，严格按照试剂盒操作要求进行。

1.2.5 JC-1 染色 各组细胞培养24 h 后，制成单细胞悬液，5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物（JC-1）染色，孵育，观察细胞中红色（JC-1 单体）和绿色荧光（JC-1 复合物）的变化，统计红色荧光和绿色荧光的比值。

1.2.6 流式细胞术 各组细胞培养24 h 后，胰酶消化细胞，离心3 min，分别收集细胞，重悬细胞后，置于FITC 标记的Annexin-V 和PI 的混合液中30 min，流式细胞仪上检测。

1.2.7 Transwell 小室侵袭实验 在Transwell 小室中平铺Matrigel 基质胶（约50 μL）并将以无血清培养基中的各组细胞的单细胞悬液（1×105/mL）加入2 mL 至上室，在小室下室平铺10%胎牛血清的培养基，培养24 h，清洗后，甲醛固定，染色后，显微镜下观察。

1.2.8 小鼠皮下种植瘤实验 将各组细胞制成单细胞悬液，将小鼠随机分为正常组、对照组、实验组（n=10）。将各组细胞单细胞悬液（1×106/mL）分别皮下注射2 mL 至对应组小鼠体内，并腹腔注射荧光标志物Luciferin，监测瘤体的淋巴转移情况。4 周后，无菌剥离瘤体，称重。

1.2.9 Western blot 检测 细胞培养24 h，裂解，常规提取总蛋白，电泳分离，转模，清洗后，封闭加入一抗（1∶500），孵育，加入二抗（1∶1 000），DAB 显色，以GAPDH 作为内参。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析。作图工具采用GraphPad 5.01，计量资料以x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌样本中miRNA-30b 和ITGB3 的表达

RT-PCR 结果显示，原位、浸润性和转移性乳腺癌组织中的miRNA-30b 相对表达量分别为0.75、0.52 和0.23，ITGB3 mRNA 分别为2.17、3.76 和5.43，与癌旁组织（1.00）相比，差异均具有统计学意义（均P<0.001，图1）。通过χ2检验和t检验分析结果显示，miRNA-30b 和ITGB3 mRNA 的相对表达与乳腺癌患者的肿瘤大小、组织学分级、TNM 临床分期相关（均P<0.001），与患者的年龄、家族史、是否淋巴转移无关（P>0.05），见表2。

图1 乳腺癌样本中miRNA-30b 和ITGB3 mRNA 的相对表达量

表2 miRNA-30b 和ITGB3 mRNA 表达与乳腺癌患者的临床病理参数的关系

2.2 miRNA-30b 靶向调控ITGB3 的表达

双荧光素酶实验结果显示，野生型ITGB3 的荧光素酶活性被抑制（P<0.001），突变型ITGB3 荧光素酶活性无明显变化（P>0.05），说明miRNA-30b 与ITGB3 具有靶向调控关系（图2，3）。

图2 miRNA-30b 和ITGB3 的结合位点

图3 双荧光素酶实验的检测

2.3 细胞转染后检测各组细胞中miRNA-30b 和ITGB3 mRNA 的相对表达

RT-PCR 结果显示，与miRNA-30b 模拟物-NC相比，miRNA-30b 模拟物中的miRNA-30b 表达明显升高，ITGB3 mRNA 的表达明显降低（均P<0.001），与miRNA-30b 模拟物相比，miRNA-30b 模拟物-pc中的ITGB3 mRNA 的表达明显升高（P<0.001，图4）。

图4 miRNA-30b 和ITGB3 mRNA 在细胞中的相对表达量

2.4 各组细胞的增殖能力

与正常组相比，实验组BrdU 阳性细胞的比例明显下降（P<0.001），与实验组相比，过表达组BrdU 阳性细胞的比例明显升高（P<0.001），正常组与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），见图5。

图5 miRNA-30b 和ITGB3 影响细胞的增殖

2.5 线粒体膜电位变化

与正常组相比，实验组细胞红色荧光与绿色荧光的比值明显下降（P<0.001），线粒体膜电位随之下降，正常组与对照组相比，差异无统计意义（P>0.05），见图6。

图6 miRNA-30b 影响细胞的线粒体膜电位

2.6 各组细胞的凋亡率

与正常组相比，实验组细胞凋亡率明显升高（P<0.001），与实验组相比，过表达组细胞凋亡率明显降低（P<0.001），正常组与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），见图7。

图7 miRNA-30b 和ITGB3 影响细胞的凋亡

2.7 各组细胞的侵袭能力

与正常组相比，实验组侵袭的细胞数量明显下降（P<0.001），与实验组相比，过表达组侵袭的细胞数量明显增多（P<0.001），正常组与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），见图8。

图8 miRNA-30b 和ITGB3 影响细胞的侵袭

2.8 各组细胞的体内生长与转移能力

与正常组相比，实验组小鼠内的瘤体重量明显减少，淋巴结转移比例明显减小（均P<0.001），正常组与对照组相比，差异无统计学意义（均P>0.05），见图9，10。

图9 miRNA-30b 影响细胞的体内生长

2.9 Western blot 检测各组细胞中的ITGB3 表达水平

与正常组相比，实验组ITGB3 的表达明显下降（P<0.001），与实验组相比，过表达组ITGB3 的表达明显升高（P<0.001），正常组与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），见图11。

图10 miRNA-30b 影响细胞的体内转移

图11 Western blot 检测ITGB3 的表达

3 讨论

目前，乳腺癌的诊断、治疗以及预后虽有较为明显的进展，但长期生存率仍不令人满意。因此，揭示乳腺癌的病因机制，阐明肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的分子机制，对于临床上开展乳腺癌的分子靶向精准治疗具有重大意义。

作为miRNA-30 家族中的一员，miRNA-30b 在多种肿瘤如胃癌、肺腺癌等中发挥抑癌作用引起广泛关注。Guan 等[9]研究证实，miRNA-30b 可抑制前列腺癌细胞的上皮间质转化过程，下调癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。郭青松等[10]研究表明，过表达miRNA-30b 可抑制胰腺癌干细胞的成瘤性。Gao 等[11]研究证实，miRNA-30b 能抑制肝癌细胞的增殖，诱导其凋亡。本研究对乳腺癌组织样本进行RT-PCR 检测结果显示，miRNA-30 呈现低表达，说明miRNA-30b 参与乳腺癌病情进展过程。本研究以miRNA-30b 模拟物转染MCF-7 细胞后，实验组细胞的增殖、侵袭、体内生长和转移能力均明显下降，细胞的线粒体膜电位明显下降，凋亡率明显升高。显示miRNA-30b 对乳腺癌细胞有良好的抑制作用。

研究显示，整合素α、β 家族参与肿瘤细胞的增殖、侵袭以及远端转移等生物学病理过程[12]。ITGB3 作为整合素β 家族的重要成员，可介导肿瘤细胞的黏附，促进癌细胞的迁移与侵袭过程。Wu 等[13]研究显示，过表达ITGB3 可增强胃癌细胞的侵袭和迁移能力。Thibaudeau 等[14]研究显示，抑制ITGB3 表达能明显抑制肺癌细胞骨转移的能力。Fuentes 等[15]研究显示，在乳腺癌组织中ITGB3 表达异常，并且与患者的不良预后相关。本研究对乳腺癌患者的组织样本检测显示，ITGB3 的表达明显升高，双荧光素酶实验结果显示miRNA-30b 能靶向调控ITGB3 表达，上调miRNA-30b 表达后，实验组细胞中ITGB3 表达明显降低；升高ITGB3 表达后，过表达组细胞的增殖与侵袭能力明显好于实验组细胞，凋亡率低于实验组，证实了miRNA-30b 与ITGB3 的靶向调控关系。

综上所述，在乳腺癌组织中miRNA-30b 和ITGB3表达异常，过表达miRNA-30b 后能明显下调ITGB3表达，抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭，并促使其凋亡，但有关miRNA-30b 在乳腺癌临床治疗的价值仍需更深入研究。