竹节参超微粉的质量标准研究

张 钰，李 鸿，郑 露，黄 毅，

金星月1，涂 星2，3*，文德鉴2，3

1.湖北民族大学医学部(湖北 恩施 445000)

2.武陵山中药材检验检测中心(湖北 恩施 445000)

3.湖北本草鉴真生物科技有限公司(湖北 恩施 445000)

竹节参为五加科植物竹节参(Panax japonicusC.A.Mey.)的干燥根茎，其味甘、微苦，性温，归肝、脾、肺经，有散瘀止血，消肿止痛，祛痰止咳，补虚的功效，常用于肺痨咯血，跌打损伤，咳嗽痰多，病后虚弱[1]，其野生资源濒临灭绝[2]，药材多为栽培品种。现代化学研究表明[3－6]竹节参含皂苷类、氨基酸、糖类、挥发油和微量元素等；其中皂苷为主要有效成分，以齐墩果烷型、达玛烷型、奥寇梯木醇型和甾醇型为主。现代药理研究发现[7－8]竹节参具有多种生物活性，对消化系统、中枢神经系统、心血管系统、免疫系统、炎症、糖尿病、肥胖、慢性疲乏综合症、肿瘤等均有不同程度的药理作用。

超微粉碎技术是将物料颗粒粉碎至微米级甚至纳米级微粉的过程。将竹节参采用现代粉体技术微粉化，既遵循了中医药理论的指导前提、保留了传统饮片的优点，又能够充分发挥微粉分散性好、溶解性强、生物利用度高的特点。但目前尚未见竹节参超微粉及其质量标准研究的相关报道。本研究以竹节参超微粉为研究对象，开展了显微鉴别和薄层鉴别，并测定其粒径，同时采用HPLC法测定其主要有效成分竹节参皂苷Ⅳa和人参皂苷Ro的含量，为其质量标准的制定和质量控制提供参考和借鉴。

1 实验材料

1.1 药材与试剂竹节参鲜品(6年份栽培品)，采于恩施市新塘乡双河镇，经湖北民族大学医学部朱敏英副教授鉴定为五加科植物竹节参[Panax ja-ponicusC.A.Mey.]的根及根茎；竹节参超微粉(批号S20191225、S20200107、S20200116，实验室自制，采用80℃干燥3 h竹节参药材高频震动研磨机于5～10℃研磨12h所制)；竹节参皂苷Ⅳa标准品(北京北纳创联生物技术研究院，批号17030201)，人参皂苷Ro(中国食品药品检定研究院，批号111903－201604)，乙腈(HPLC级，批号20200906)、甲醇(HPLC级，批号20201115)，均购于国药集团化学试剂有限公司，其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器高频震动研磨机(LRVM－MHS－BE型，山东龙脉科技发展有限公司)；智能激光粒度分析仪(Winner3003型，济南微纳颗粒仪器股份有限公司)；高效液相色谱仪(LC－2030C，日本岛津公司)；电子分析天平(XSR105/AC，梅特勒公司)；超纯水机(Mili－Q Direct－Q©5UV，法国密理博)；数控超声波清洗器(KQ－500DE型，昆山市超声仪器有限公司)；循环水真空泵(SHZ－Ⅲ型，上海亚荣生化仪器厂)；高速多功能粉碎机(YB－2000A型，浙江永康市速锋工贸有限公司)；全自动移液器(S1200 Smartpipette型，量程50～1 200μL，ronlabs公司)，离心机(TD5A－WS型，湖南湘仪)。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别竹节参超微粉末呈黄白色，取竹节参超微粉粉末装片，显微镜下400倍观察。可见极少量破碎厚角细胞和木栓细胞，破碎树脂道、油细胞和淀粉粒较常见，见图1。

2.2 薄层色谱鉴别取竹节参超微粉1.2 g，加60%甲醇溶液25 mL，超声40min，3000 r/min离心5 min，取上清液经0.22μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液。取人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa对照品，分别加入60%甲醇制成每1 mL溶液含人参皂苷Ro、含竹节参皂苷Ⅳa1 mg的溶液作为对照品溶液。吸取供试品溶液、对照品溶液各10μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－甲酸－水(4.5∶1.5∶0.1∶0.3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸－乙醇溶液，在105℃下加热至斑点显色清晰，见图2。

图2 竹节参粉末薄层鉴别图

2.3 竹节参超微粉粒径分布取所制备的3批次竹节参超微粉，采用激光散射粒度分布仪测定其粒径分布，以空气作为介质，分散气压0.2 MPa，物质折射率1.520/0.1(实部/虚部)，介质折射率1.000，折光率3～20，采用R－R分布模式进行分析，以D90粒径作为衡量粒径的标准。测定3次，竹节参超微粉的D90粒径均＜100μm，见表1。

表1 竹节参超微粉粒径分布

2.4 竹节参主要有效成分的含量测定

2.4.1 溶液的制备

2.4.1.1 对照品溶液的配制 分别精密称取人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa对照品适量，加60%甲醇溶解制成每1 mL含1.0 mg的溶液，即得。

2.4.1.2 供试品溶液的配制 精密称取竹节参超微粉1.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，精密称定其重量，25℃超声处理(功率500 W，频率28 KHz)40 min，精密称重，补足减失的量，以3000 r/min，离心5 min，取上清液，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4.2 色谱条件及系统适用性 以Shim－pack GIS C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)为固定相，以乙腈－0.15%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱:0～3 min，25∶75；3～11 min，25∶75→33∶67；11～35 min，33∶67；35～40 min，33∶67→37∶63；40～50 min，37∶63；检测波长203 nm；柱温40℃，进样量20 μL。取2.4.1项下对照品溶液、供试品溶液及60%甲醇按2.4.2项下色谱条件进样(见图3)。在该色谱条件下，人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa的保留时间分别为10.3、17.5 min，分离度R＞1.5，理论塔板数以人参皂苷Ro≥10 000，表明样品中的人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa分离良好，阴性无干扰。

图3 HPLC图谱

2.4.3 线性关系考察 精密量取2.4.1项下人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa标准品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0于5 mL容量瓶中，用60%甲醇定容即得浓度分别为20、40、100、200、400μg/mL的系列标准品溶液。将对照品溶液按2.4.2项下色谱条件进行测定，以对照品溶液浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果人参皂苷Ro标准曲线为Y＝15396.4509X－6214.1312，r＝0.9997；竹节参皂苷Ⅳa标准曲线为Y＝29 686.483 5X－963 3，r＝0.9998。结果表明人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa在20～400μg/mL范围内线性关系良好。

2.4.4 精密度实验 取2.4.1项下20、40、100μg/mL的人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa对照品溶液，按2.4.2项下的色谱条件下重复进样6次，每次进样10μL，以峰面积计算稳定性RSD。人参皂苷Ro的RSD分别为1.71%、1.37%、1.21%，竹节参皂苷Ⅳa的RSD分别为1.52%、0.95%、0.87%，表明仪器精密度良好。

2.4.5 稳定性实验 取2.4.1项下S20191225批次供试品溶液，室温放置，分别于0，2，4，6，8，10，12，18，24 h时分别进样，测定峰面积。结果人参皂苷Ro峰面积RSD为3.07%，竹节参皂苷Ⅳa峰面积RSD为2.31%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.6 重复性实验 取S20191225批次竹节参超微粉6份，按照2.4.1项下方法制备供试品溶液，照2.4.2项下色谱条件进样测定。结果人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa峰面积RSD分别为1.65%、1.87%，表明本方法重复性较好。

2.4.7 加样回收实验 精密称取9份0.1 g已知人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa含量分别为4.74%、3.51%的竹节参超微粉，分别加入人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa标准品(相当于超微粉中竹节参皂苷Ⅳa含量的80%、100%、120%)，按2.4.1项下制备方法制备供试品溶液，并按2.4.2项下进样，计算平均回收率。人参皂苷Ro平均加样回收率分别为99.75%、100.78%、98.35%，RSD分别为0.75%、2.44%、0.45%；竹节参皂苷Ⅳa平均加样回收率分别为98.52%、101.13%、100.28%，RSD分别为1.14%、1.17%、2.17%，见表2、表3。

表2 人参皂苷Ro加样回收率试样结果

表3 竹节参皂苷Ⅳa加样回收率试样结果

2.4.8 人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa含量测定 取2.4.1项下供试品溶液，按照2.4.2项下色谱条件进样，供试品进样3次，测定峰面积，计算人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa含量，见表4。

表4 竹节参中竹节参皂苷Ⅳa含量的测定结果

3 讨论

中药超微粉是对传统中药材进行处理后保留活性成分的粉末[9]。中药超微粉碎后可以充分提取其化学成分，但可能会存在部分物质的丢失和不良反应的发生，中药超微粉技术有95%以上的细胞破壁率，能使在细胞核和细胞质内的中药活性成分迅速释放，发挥作用[10－12]。超微粉碎后中药材原有的性质发生了破坏，细胞破壁后的显微特征破坏较为明显，这导致原有的一些传统方法不再是鉴别超微粉的主要方式[13]，所以需要一些方法来建立中药超微粉的质量标准。本研究发现，竹节参的显微组织结构发生了显著变化，见不到完整的导管、簇晶等鉴别特征，仅能见到碎片，D90粒径均低于100μm，提示所制备的超微粉达到了破壁的基础要求。本研究所建立的薄层色谱鉴别和含量测定方法与中国药典要求一致，但所测得人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa含量均超过3.0%，远超过药典规定的1.5%限度标准[1]，可能与本研究所用药材为6年生有关，也可能是超微粉有效成分溶出率增加所致，有待进一步研究。