参芪地黄汤治疗糖尿病肾病的网络药理学机制

吴 健，付彤飞，袁 军，2，3*

1.湖北中医药大学(湖北 武汉 430000)

2.湖北省中医院(湖北 武汉 430000)

3.湖北省中医药研究院(湖北 武汉 430000)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是终末期肾脏疾病(ESRD)最主要原因[1]。我国糖尿病患者中约有33.6%发生DN，越来越年轻化，相关数据显示在所有透析患者中DN患者占比高达34.39%[2]。中医认为其是由于素体肾虚，消渴病迁延日久，导致五脏受损，气阴两虚，兼夹痰湿、浊毒、血瘀等致病[3]。发病初期表现为气阴两虚，逐渐发展导致肝肾阴虚，病久迁延不愈，阴损及阳，累及脾肾，最后肾阳衰败，痰湿、浊毒、血瘀等病理产物累积，最终使得五脏俱损、气血亏虚。因此临床上对DN的治疗是以健脾益肾，益气养阴为主，并随着病理产物的变化进行加减。参芪地黄汤在临床上常常被用来治疗DN，Meta分析结果显示[4]在用西药的基础上联合参芪地黄汤比单用西药更能降低肌酐，减少蛋白尿，改善全身症状。

虽然目前参芪地黄汤治疗DN有较好的临床疗效，但对参芪地黄汤治疗DN的作用机制的研究仍显不足。本研究通过利用网络药理学方法探讨参芪地黄汤治疗DN的作用机制，为临床上的运用及科研提供更多的理论依据和参考。

1 方法

1.1 参芪地黄汤药物活性成分的筛选将参芪地黄汤全方中的黄芪、人参、山药、熟地黄、山茱萸、牡丹皮、茯苓分别输入中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中，依据各个成分的吸收、分布、代谢及排泄，即ADME参数筛选有效成分，把其中的阈值条件设置为生物利用度(OB)≥30%，化合物类药性(DL)≥0.18。

1.2 参芪地黄汤潜在作用靶点的筛选及基因名的转换把筛选出来的化合物分别输入到TCMSP数据库中，预测参芪地黄汤潜在的作用靶点并保存。以“Organism”中的“Homo sapiens(Human)”为限定条件，把筛选出来的潜在作用靶点输入到UniProt(http://www.uniprot.org)数据库中，进行基因名的查找与转换并导出保存。

1.3 DN靶点的筛选在GeneCards(http://www.genecards.org/)数据库中，以“diabetic nephropathy”为关键词，输入其中筛选DN的潜在靶点，并以Excel格式导出保存；以“Gene Map”为筛选条件，把“diabetic nephropathy”关键词输入到OMIM(http://www.omim.－org/)数据库中，筛选潜在靶点并以Excel格式导出保存。

1.4 药物－疾病网络图的构建将“VennDiagram”安装包安装到Rx64 3.6.2软件中去，把“1.2”“1.3”筛选出来的基因名和疾病靶点导入，构建Venn图，筛选出药物和疾病共同作用的靶点；同样将“1.2”筛选出来的基因名和药物－疾病共同作用的靶点输入到Cytoscape 3.7.2软件中去构建成分－靶点－基因－疾病网络图。

1.5 蛋白质－蛋白质(PPI)网络的构建及基因功能(GO)和通路分析(KEGG)将筛选出来的药物－疾病共同作用的靶点输入到STRING(http://string－db.org/)数据库中去，在“Multiple proteins”选项中以“Homo sapiens”为条件，构建药物－疾病PPI核心靶点网络图；以P≤0.05为条件，通过Rx64 3.6.2软件和Bioconductor生物信息软件包中的“pathview”“DOSE”“clusterProfiler”安装包，对疾病靶点和药物靶点的交集基因做GO功能富集和KEGG通路分析。

2 结果

2.1 药物活性成分的筛选通过TCMSP数据库平台及阈值筛选条件共筛选得到106个符合条件的化合物，其中黄芪20个、人参22个、山药16个、熟地黄2个、山茱萸20个、牡丹皮11个、茯苓15个，这些成分包括山奈酚、谷甾醇、槲皮素等。

2.2 药物靶点及靶点基因的筛选通过TCMSP数据库平台共筛选出参芪地黄汤1293个潜在作用靶点，其中黄芪462个、人参256个、山药144个、熟地黄34个、山茱萸130个、牡丹皮237个、茯苓30个，再通过UniProt数据库对潜在靶点名称标准化，最终得到1 010个靶点基因，用Excel去掉重复的，共得到药物靶点基因202个。

2.3 疾病靶点的筛选在GeneCards和OMIM数据库中共得到疾病靶点3746个，从GeneCards数据库中得到3069个，OMIM数据库中得到677个，用Excel去掉重复的，共筛选得到疾病靶点基因3241个。

2.4 参芪地黄汤“成分－靶点”网络图表的构建通过Cytoscape 3.7.2软件、Rx64 3.6.2软件构建“药物－疾病Venn图”“成分－靶点”网络关系图(见图1、2，表1)，其中节点之间的相互作用用连线表示，节点连线越多，说明这个靶点或化合物在整个网络中起着关键性的作用。

由图1、2，表1、2可知，筛选出药物活性成分靶点与疾病靶点相互作用的有133个，参芪地黄汤中有50个活性成分对DN有调节作用，其中槲皮素度值201、豆甾醇度值124、山奈酚度值53等与DN靶点交互作用较多，提示参芪地黄汤中这些活性成分在治疗DN的机制中起着关键性的作用。

表1 参芪地黄汤治疗DN的50种有效成分

图1 药物－疾病Venn图

图2 参芪地黄汤“成分－靶点”网络图

2.5 PPI网络图将药物靶点与疾病靶点的交集输入到STRING数据库中，以“Homo sapiens”为筛选条件，从而得到蛋白相互作用的网络关系图(见图3)，其中节点数有133个，边数有2 393个，平均节点度36。同样把药物靶点与疾病靶点相互作用的交集导入到Rx64 3.6.2软件，筛选靠前的30个核心基因(见图4)，这些基因主要涉及到细胞的增殖和生长、炎症因子白细胞介素－6(IL－6)、血管内皮生长因子、细胞凋亡的调节等方面。

图3 DN PPI相互作用网络图

图4 参芪地黄汤治疗DN PPI核心靶点网络图

续表1

2.6 GO功能富集和KEGG通路分析GO功能富集分析得到123个条目，取P值最小的20个条目，绘制柱状图(见图5)，其中受体配体活动是最为明显的生物过程，涉及到18个潜在作用靶点，因此这可能是发挥治疗效果最重要的生物过程，其次还包括细胞因子受体结合、RNA聚合酶II近端启动子序列特异性DNA结合、细胞因子的活性、内肽酶活性、核受体活性、类固醇激素受体活性等方面。KEGG通路分析共得到167条信号通路，取P值最小的20个条目，绘制柱状图(见图6、表3)，其中最显著的信号通路有糖尿病并发症中的AGE－RAGE信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、MAPK信号通路、HIF－1信号通路、IL－17信号通路、TNF信号通路等，参芪地黄汤的有效成分可能通过以上通路来发挥治疗作用。

图5 参芪地黄汤治疗DN GO功能分析柱状图

图6 参芪地黄汤治疗DN KEGG通路富集分析柱状图

表3 参芪地黄汤治疗DN的KEGG通路分析

续表3

3 讨论

现代医学认为DN发生的主要机制与糖脂代谢的异常、炎症因子的释放、氧化应激反应、血管及血液动力学的改变、细胞的凋亡、多种通路的激活等密切相关[5]。在这些机制的综合作用下最终导致了肾小球膜细胞的增生和肥大、肾小球足细胞的损伤或凋亡、基底膜的增厚、肾间质不断纤维化、肾小管肥大等肾脏病理性的改变[6－8]。中医认为DN主要是由于燥热阴虚，津伤气耗，后期会阴损及阳，从而出现阴阳两虚或阳虚水肿。DN气阴两虚型的治疗主要采用参芪地黄汤[9]。参芪地黄汤由六位地黄丸去泽泻加人参、黄芪演变而来，方中黄芪益气固表、补气升阳，助脾升清，使精微物质上行而不下泄，人参加强补气作用，六味地黄丸阴中求阳、滋阴补肾，全方位起到健脾益肾，益气养阴的作用。目前研究显示[10]参芪地黄汤的临床疗效可能是通过增加肾上腺促皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)分泌、增强下丘脑－垂体－肾上腺轴(hypothalamic－pituitary－adrenal axis，HPA)的功能来抑制肾小球硬化、间质纤维化、肾小管萎缩、炎症因子的释放和免疫应答反应，从而发挥降低肌酐、减少蛋白尿，保护肾脏，改善全身症状的作用。复方中药治疗疾病具有多成分、多靶点、多通路的特点，但其作用于人体的机制十分复杂，单纯用传统的方法很难解释药物的有效成分与人体内生物分子之间的关系，而网络药理学克服了传统的“单基因－单受体－单机制”研究方法[11]，把中药、有效成分、潜在作用靶点、相关疾病之间作用的关系，通过生物分子网络角度的形式展现出来，进而阐释了复方中药治疗疾病的作用机制。

通过网络药理学，筛选得到参芪地黄汤中有50种有效成分可能对DN有治疗作用，由表2可知槲皮素、山奈酚、豆甾醇、薯蓣皂苷元是其中最主要的有效成分。槲皮素不仅能调节丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、氧化应激反应，减轻胰岛素抵抗[12]，改善糖脂代谢[13]，而且还能增强足细胞nephrin和podocin的表达，减轻DN中足细胞的损伤[14]，进而减少蛋白尿、发挥治疗DN的作用；山奈酚可以抑制晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end products，AGEs)的形成、改善糖尿病内皮功能障碍，提高微血管管腔形成的能力，减少糖尿病血管并发症的发生[15]，还可以通过激活BMP－7－Smad1/5信号通路防止肾脏纤维化[16]，起到保护肾脏的作用；豆甾醇不仅可以通过阻止游离胆固醇和活性氧(ROS)的积累，改善胰岛素分泌，增加胰岛素含量以及减少早期凋亡的标志物来保护胰岛β细胞免受糖脂毒性[17]，从而改善血糖代谢，而且还可以明显改善高脂西餐饮食(HFWD)诱导的小鼠脂肪肝和代谢异常，降低肠道肝总脂质、三酰甘油、胆固醇等的水平[18]，起到调节血脂代谢的作用；薯蓣皂苷元既可以通过调节p38MAPK和氨基末端激酶(JNK)途径的激活，进一步抑制核转录因子－κB(NF－κB)的磷酸化并调节下游炎性细胞因子的表达，起到抗炎，减少炎症损伤的作用[19]，又可以在链脲佐菌素诱导大鼠糖尿病中，防止血清肌酐的积累并减少尿蛋白排泄，从而显著降低肾脏肥大指数，改善肾脏功能[20]；此外黄芪中的黄芪甲苷能够通过抑制MAPK信号途径的活化来降低转化生长因子－β1(TGF－β1)和p38的活性，进一步影响高葡萄糖诱导的人肾小管上皮细胞的细胞凋亡[21]。

表2 以Degree数值大小取参芪地黄汤治疗DN的前15种有效成分

通过对参芪地黄汤治疗DN核心靶点的预测，发现AKT1、IL－6、VEGFA、半胱天冬酶3(CASP3)、JUN、环 氧 合2(PTGS2)、MAPK1、EGF、EGFR、MAPK8等是发挥疗效的主要靶点，AKT1靶点参与细胞的迁移、增殖、生长，而且还有调节糖脂代谢的作用[22]；IL－6是内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞在炎症刺激下产生的，它能促进T细胞的增殖和B细胞的分化，参与免疫反应及炎症反应[23]；VEGFA是血管内皮生长因子(VEGF)蛋白家族的成员之一，而VEGF能诱导内皮细胞分化，增殖，迁移，同时促进血管通透性的增加[24]，影响肾脏血液循环；CASP3主要参与细胞凋亡的调控；PTGS2能催化花生四烯酸向前列腺素的转变，而前列腺素是炎症的关键介质[25]；MAPK1、MAPK8属于MAPK家族类，当它们在氧化应激、DNA损伤、癌发展和病毒感染的条件下迅速被激活[26]，参与炎症反应。总之这些核心靶点主要涉及到炎症反应、氧化应激反应、免疫调节以及对细胞的调控等方面。而炎症和氧化应激在DN的发生和发展中起主要作用[27]，因此这些靶点是参芪地黄汤治疗DN的主要靶点。

GO生物功能富集分析其中最主要的生物过程是受体配体活性、细胞因子受体结合、RNA聚合酶II近端启动子序列特异性DNA结合、细胞因子活性等4个条目，这些生物过程在参芪地黄汤治疗DN中起着关键性的作用。KEGG通路分析共得到167条信号通路，取P值最小的20个条目，分别是晚期糖基化终末产物(AGE)－糖基化科末产物受体(RAGE)信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、MAPK信号通路、缺氧诱导因子－1(HIF－1)信号通路、IL－17信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等。其中AGE－RAGE信号通路是最主要的信号通路，不仅参与激活NF－κB、VGEF、TGF－β1、单核细胞趋化蛋白－1(MCP－1)、MAPK等多个细胞因子，引起肾脏一系列的病理改变[28]，而且还能激活ERK1/2MAP激酶途径来介导肾小管上皮－成纤维细胞转分化[29]；肾脏疾病常常伴缺血缺氧，而缺血缺氧又能抑制HIF－1的降解，当肾脏发生疾病时，HIF－1因此而被激活，HIF－1是缺氧反应最为主要的蛋白，在多种肾脏疾病中都有上调，它可以通过直接调控下游靶基因、并与其他信号通路相互作用、表观遗传学修饰参与肾脏疾病的发展[30]；MAPK通路是由胞外调节蛋白激酶[细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)，即p44/42]通路、c－JUN氨基末端激酶(SAPK/JNK)通路、p38MAPK通路3部分构成，该通路的激活可以导致炎症细胞因子的生成，促进炎症反应[31]；IL－17信号通路和TNF信号通路是在炎症反应中起重要作用的通路，TNF－κB通路可以通过影响细胞因子、细胞黏附因子、趋化因子等的表达来发挥其作用，是参与炎症和免疫反应的主要通路之一[32]。其它通路还涉及到病毒感染等方面。

通过网络药理学的研究发现参芪地黄汤中的槲皮素、山奈酚、豆甾醇、薯蓣皂苷元等50种有效成分能够作用于AGE－RAGE、流体剪切应力和动脉粥样硬化、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、MAPK等167条信号通路，来参与调控细胞的增殖与生长、丝裂原活化蛋白激酶、血管内皮生长因子、炎症因子等133个靶点，最终达到治疗DN的作用。但也存在着不足，需要后期临床实验做进一步的论证。