广西壮族哮喘人群5-HTT基因rs3794808位点多态性与CD4+T淋巴细胞因子平衡的关系研究①

蒙明虑 许建国 陈高 马迎教（右江民族医学院公共卫生与管理学院，百色533000）

支气管哮喘（简称哮喘）是由多种细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症、气道壁重塑和气道高反应性疾病，是一种严重危害人类健康的身心疾病［1］。哮喘和焦虑、抑郁等精神性疾病的发病机制存在关联，且与5-羟色胺转运体（5-HTT）基因多态性的功能作用有关［2-3］。以往研究发现哮喘的高气道反应主要是由免疫功能障碍引起，其中CD4+T淋巴细胞4个亚群：辅助性T细胞Th1、Th2、Th17和调节性T细胞Treg起着至关重要的作用，Th细胞因子的异常表达、Th1/Th2、Th17/Treg免疫失衡是哮喘发病的免疫学机制［4-5］。为探讨广西壮族哮喘人群的5-HTT基因rs3794808位点多态性是否通过影响CD4+T淋巴细胞因子的平衡进而影响哮喘的发病，本研究采用病例对照研究方法，观察rs3794808位点多态性对CD4+T淋巴细胞因子平衡状态的影响，为5-HTT基因参与哮喘发病机制的研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 临床资料将广西西部地区三甲医院收集的221例壮族哮喘患者作为病例组，以208例壮族健康体检者作为对照组。全部调查对象均在广西长期生活、三代均为壮族、未与其他民族通婚，均签署知情同意书。本研究通过右江民族医学院医学伦理委员会审批（伦理审查号2017030501）。哮喘诊断标准符合中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制定的《中国支气管哮喘防治指南》［6］，病例组排除标准：①上呼吸道功能不全，慢性阻塞性肺疾病（COPD），气管软化等引起的喘息及合并其他呼吸系统疾病；②严重心血管疾病、严重肝肾功能不全等其他系统的严重疾病；③合并自身免疫系统疾病、恶性肿瘤等疾病。对照组是常规体检的健康人，近1个月内无急性上呼吸道感染、胸部X线检查未见异常、无哮喘病史及典型过敏史、无自身免疫性疾病史。

共收集病例组221例，其中男性113例（51.1%），女性108例（48.9%），年龄24~85岁，平均年龄（53.21±13.88）岁；对照组208例，其中男性105例（50.5%），女性103例（49.5%），年龄20~89岁，平均年龄（53.13±15.91）岁，两组性别、年龄差异均无统计学意义（χ2=0.018，P=0.893；t=0.058，P=0.954），资料具有可比性。

1.1.2 试剂及仪器基因分型在北京六合华大基因科技有限公司完成；细胞因子检测试剂购自TaKaRa公司；基因扩增仪ETC811购自东胜创新生物科技有限公司；DNA测序仪购自Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 标本收集抽取外周静脉血5 ml，经乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）抗凝，其中1 ml血标本用于提取DNA，4 ml血标本用于血清细胞因子水平的检测。

1.2.2 基因组DNA提取1 ml抗凝血全用于提取DNA，使用TaKaRa公司人全血基因组DNA试剂盒提取DNA，严格按照说明书步骤提取DNA，分装置于-80℃冰箱保存待用。

1.2.3 基因分型采用SNP的PCR重测序法对rs3794808位点进行基因分型。PCR扩增上游引物：5'-CTAACCCAGGCTCCTCA-3'，下 游 引 物：5'-TC‐GCTTTACCCTCATCT-3'。PCR扩增反应体系：DNA模板1 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，BGI 2×Su‐per PCR Mix 15 μl；RNase-free H2O 12 μl（总反应体积30 μl），配好反应体系后基因扩增仪上执行以下反应程序：96℃预变性5 min；96℃变性20 s，52℃退火30 s，72℃延伸60 s，共10个循环；96℃变性20 s，52℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30个循环；72℃延伸5 min，反应完成后，将反应物4℃保存。将DNA扩增产物用于测序。测序反应体系为：2 μl Mix（Big‐dye3.1、5×sequencing buffer、H2O），2 μl纯 化 后 的PCR产物，1 μl引物（5 mmol/L）。测序反应程序为：循环条件为：95℃15 s→（95℃15 s→50℃5 s→60℃90 s）×35个循环，反应完成后，将反应物4℃保存，用ABI 3730XL型DNA测序仪进行测序，部分测序结果，见图1。

1.2.4 细胞因子水平检测采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17水平，所有试剂均购于TaKaRa公司，整个过程严格按照说明书步骤操作。

1.3 统计学分析采用GraphPad Prism 5.0统计分析软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验分析；符合正态分布的计量资料以xˉ±s表示，两独立样本t检验进行两组间均数比较，以单因素方差分析进行多组间均数比较，组间多重比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组人群SNP位点基因分型及等位基因频率病例组及对照组的基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡定律检验（χ2=1.067，P=0.893；χ2=0.002，P=0.967），说明两组人群均具有代表性；病例组和对照组在rs3794808的基因型频率和等位基因频率差异均有统计学意义（P<0.05）；如图1、表1。

表1 两组人群5-HTT基因rs379808位点基因型及等位基因频率的比较［频数（%）］Tab.1 Comparison of polymorphism distribution of locus rs3794808 of 5-HTT gene in two groups［Frequen⁃cy（%）］

图1 5-HTT基因rs3794808位点5-3′UTR测序结果Fig.1 Direct sequencing graph of locus rs3794808 at 5-3'UTR of 5-HTT gene

2.2 5-HTT基因多态性与哮喘的关联性分析5-HTT基因rs379808位点CT基因型与TT基因型差异无统计学意义（P>0.05），CC基因型、CT+CC基因型与TT基因型差异有统计学意义（P<0.05），CC基因型发生哮喘的危险度是TT基因型的3.090倍（95%CI：1.084~8.808），C等位基因患哮喘的风险是T等位基因的1.608倍（95%CI：1.136~2.276）。见表2。

表2 5-HTT基因rs379808位点基因型的相对危险度分析Tab.2 Relative risk analysis of locus rs3794808 of 5-HTT gene

2.3 两组人群细胞因子水平比较病例组血清中的IFN-γ和IL-10水平低于对照组，而IL-4和IL-17水平明显高于对照组；与对照组相比，病例组的IFN-γ/IL-4较低，而IL-17/IL-10较高，差异均有统计学意义（P<0.001）。见表3。

表3 两组人群血清细胞因子水平的比较（±s）Tab.3 Comparison of serum cytokine levels between two groups（±s）

表3 两组人群血清细胞因子水平的比较（±s）Tab.3 Comparison of serum cytokine levels between two groups（±s）

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2.4 病例组中不同基因型哮喘患者细胞因子水平的比较携带不同基因型的哮喘患者血清中各细胞因子水平差异均有统计学意（P<0.001）；多重比较显示，与携带TT基因型哮喘患者相比，CC基因型哮喘患者血清中IFN-γ和IL-10的浓度较低，而IL-4和IL-17的浓度较高，IFN-γ/IL-4较低，而IL-17/IL-10较高；CT基因型哮喘患者与TT基因型哮喘患者相比较，血清中IL-17较低，IL-17/IL-10较高。见表4、图2。

图2 不同基因型哮喘患者血清细胞因子水平的比较Fig.2 Comparison of serum cytokine levels in patients with asthma of different genotypes

表4 病例组中不同基因型哮喘患者血清细胞因子水平的比较（±s）Tab.4 Comparison of serum cytokine levels in patients with asthma of different genotypes in case group（±s）

表4 病例组中不同基因型哮喘患者血清细胞因子水平的比较（±s）Tab.4 Comparison of serum cytokine levels in patients with asthma of different genotypes in case group（±s）

Note：Multiple comparisons，there were significant differences between CC and TT，CT and TT genotypes，1）P<0.001.

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3 讨论

哮喘是一种以慢性气道炎症为特征的异质性疾病，由于无法完全治愈、反复发作且普遍存在焦虑、抑郁等精神问题，哮喘患者患精神性疾病的风险更高［7-8］。哮喘和焦虑、抑郁等精神性疾病之间存在共同的遗传易感性，重度抑郁的多基因风险评分（PRS）与儿童哮喘风险升高有关［9-10］，以往研究表明，体内5-HTT基因表达减少会增加哮喘和抑郁的风险［3］，5-HTT基因Stin2多态性与台州地区汉族人群哮 喘 的发 生 呈显 著 相关［11］，虽 然5-HTT基 因rs3794808位点与哮喘的关系鲜有报道，但有研究证实该位点与抑郁等精神性疾患有关联［12］，而哮喘又是一个典型的心身疾病，因而该位点与哮喘的关系值得探讨和研究。本课题组在前期研究中发现，5-HTT基因rs3794808位点多态性可能是壮族人群哮喘发病的潜在遗传易感性标志，5-HTT作为免疫调节剂，参与了炎症反应过程，与哮喘发作有关［13］。为了探讨5-HTT基因rs3794808位点与哮喘的关系是否通过调节细胞因子网络发挥免疫调节作用，本研究进行了病例对照研究，发现5-HTT基因rs3794808位点CC基因型和C等位基因是壮族人群哮喘发病的危险因素，与前期研究结果一致［13］，在此基础上，通过检测CD4+T淋巴细胞因子进一步了解5-HTT基因rs3794808位点多态性与Th1/Th2、Th17/Treg平衡的关系。

哮喘的慢性气道炎症由多种细胞免疫参与反应，Th1/Th2细胞及其细胞因子失衡是哮喘发病的基础［14］。在正常机体中，IFN-γ和IL-4互相拮抗，维持Th1/Th2平衡，当机体受变应原刺激时，Th1/Th2失衡，Th2占优势，分泌大量IL-4，抑制IFN-γ活性，促进炎症介质释放，使杯状细胞增生，气道黏液分泌增多，气管增厚，导致气道狭窄而促使哮喘发作［15-16］。Th2细胞分泌的IL-4是慢性炎症和气道高反应性的关键调节因子，哮喘患者血清的IL-4高于正常对照组，Th1分泌的IFN-γ可抑制轻度和中度哮喘的发作，IFN-γ与哮喘的严重程度呈负相关［17］。LIANG等［18］对哮喘小鼠的研究发现，与健康对照小鼠比较，哮喘小鼠的IFN-γ水平降低，IL-4水平升高，体内Th1/Th2免疫失衡。有报道糖皮质激素通过抑制Notch1信号传导，调整小鼠哮喘过敏性气道炎症中涉及的Th1/Th2平衡从而达到抗炎的目的［19］。本研究发现，与对照组相比，壮族哮喘人群的IFN-γ水平降低而IL-4水平升高，IFN-γ/IL-4较低，说明Th1/Th2细胞因子免疫失衡参与了壮族人群哮喘炎症反应的发生。

以往对哮喘的研究主要集中在Th1/Th2细胞免疫失衡，但随着研究的深入，发现Th1/Th2细胞免疫失衡不足以说明哮喘的炎症反应，哮喘还与Th17和Treg失衡有关［20］。Th17细胞经过活化后诱导生成IL-17，IL-17会募集中性粒细胞，促进炎症细胞因子在气道内的大量表达［21］，导致组织破坏和炎性细胞浸润，打破体内的稳态平衡，进一步加剧哮喘的发作。Treg细胞分泌TGF-β、IL-10等细胞因子，抑制嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞的活化，减轻Th2细胞因子IL-4的分泌，从而抑制气道炎症反应，抑制哮喘的发生。有研究发现哮喘患儿的Th17细胞频率升高、Th17/Treg升高，而且与气道高反应性相关，在对儿童及成人哮喘的研究中都观察到了Th17/Treg细胞因子的失衡，并与成人哮喘病情的严重程度有关［22-24］。本次研究发现壮族哮喘人群的IL-10水平比较低，IL-17水平明显高于对照组，IL-17/IL-10增高，提示Th17/Treg细胞因子在壮族哮喘人群中比例失衡。为哮喘的靶点治疗提供理论依据。

本研究显示5-HTT基因rs3794808位点CC基因型发生哮喘的危险性是TT基因型的3.090倍（95%CI：1.084~8.808），为了解5-HTT基因型的差异是否影响Th细胞因子平衡，对不同基因型哮喘患者的细胞因子水平的比较显示，与携带TT基因型哮喘患者相比，CC基因型哮喘患者血清中的IFN-γ和IL-10表达下降，IL-4和IL-17表达升高，IFN-γ/IL-4降低及IL-17/IL-10增高，提示5-HTT基因多态性可能与CD4+T淋巴细胞因子的表达有关，有可能通过影响Th1/Th2、Th17/Treg平衡从而影响哮喘的发病，此结果从另一个角度为哮喘机制研究提供了切入点和线索，但其中的复杂机制还有待进一步的研究证实。