苏格木勒-7 对CTX致卵巢功能低下大鼠的卵巢功能保护作用研究

春 莲,吴伟乐斯,其勒木格,布仁巴图

(1.内蒙古民族大学附属医院 蒙妇科一,内蒙 通辽028000；2.内蒙古包头医学院 内蒙 包头014000；3.内蒙古民族大学蒙医药学院,内蒙 通辽028000；4.内蒙古民族大学附属医院,内蒙 通辽028000)

卵巢储备功能下降(DOR)进一步可发展为卵巢早衰(POF)[1-5]，目前尚无有效可行的方法能促进受损卵巢功能的恢复。苏格木勒-7(苏-7)成分能够调节机体内分泌和性激素功能，故本试验探讨苏格木勒-7对环磷酰胺(CTX)致卵巢功能低下大鼠卵巢功能保护作用的研究，为临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组10周健康 SD 雌性大鼠 100 只和10周健康 SD 雄性大鼠 12只，体重 170-200 g 左右，购自辽宁长生生物技术股份有限公司。实验动物饲养于内蒙古民族大学附属医院动物实验室。实验开始时鼠龄12周3天。购买的动物先适应性喂养 7 天后禁食、不禁水 10 h，第 8 天晨测体重并开始取阴道细胞检测性周期，共 10 天，剔除无规律性周期和无发情的鼠 4 只，剩余 96 只正常性周期的大鼠按体重排序按随机数字表随机区组法分 6 组(n=16)，分别为模型组(CTX)、模型加戊酸雌二醇组(补佳乐组)、模型加苏格木勒-7 低剂量组(CTX+苏-7-0.5 g)、模型加苏格木勒-7 中剂量组(CTX+苏-7-1.0 g)、模型加苏格木勒-7 高剂量组(CTX+苏-7-2.0 g)和正常组。

1.2 动物模型的建立及苏格木勒-7干预方案

1.2.1建立动物模型 本课题采用 CTX 构建卵巢功能损伤模型已经相当成熟，CTX30 mg/kg·d 连续给药 7 天的模型最理想，此方案的大鼠原始卵泡数显著减少，AMH 表达下降，卵巢内分泌和生殖功能显著下降，认为此模型最理想。除了正常组外其他5组均连续7天腹腔注射 CTX 30 mg/kg·d。每天早上 8 点对大鼠进行阴道细胞涂片分析，一直到实验结束，发情周期出现紊乱或无发情周期代表模型成功。

1.2.2药物制备与给药方法 苏-7 由内蒙古民族大学附属医院制剂室提供(符合 GPP 标准制剂室)。正常组和模型组等量生理盐水灌胃，其余给药组在造模第一天开始(建模同时)分别灌胃给予苏-7 高剂量(2.0 g/kg·d)、中剂量(1.0 g/kg·d)、低剂量(0.5 g/kg·d)和戊酸雌二醇(0.1 mg/kg·d)，每天给药一次，连续给药 24 天。所有大鼠均每天监测发情周期、每周两次检测体重、根据体重重新计算给药剂量、每天检测饮食计量、观察鼠状态、毛色、活动等情况。

1.3 生育能力检测造模7天+给药24天后，从 6 组中随机选取 24 只大鼠(每组 4 只)，于动情期以 2∶1 比例分别与健康且年龄匹配的雄性大鼠进行交配，记录怀孕鼠和新生鼠的数量、存活情况。

1.4 血清及各脏器标本采集造模 7 天+给药 24 天后，剩余大鼠于动情间期进行麻醉后打开腹腔，腹主动脉取血，分离血清并送检验室以备 ELISA 法检测血清激素水平变化。采完血后迅速分离左侧卵巢，分为两部分，分装在两个速冻管内迅速置于液氮中，-80℃保存；分离右侧卵巢、称重后用 10%中性福尔马林固定后送至病理科进行卵巢连续切片，HE 染色光镜下观察卵巢组织形态学变化及记录不同阶段卵泡的数量；随后依次完整取出并分离其他脏器(子宫、肝脏、肾脏、脾脏)，光镜观察其形态结构是否正常并称重。

1.5 观察指标每天取阴道脱落细胞观察动情周期，大鼠体重及各脏器重量；ELISA 法检测血清 E2、FSH、AMH；HE 染色光镜下观察卵巢组织形态学变化及记录不同阶段卵泡数量；记录怀孕鼠和新生鼠的数量及存活情况。

1.6 统计学方法SPSS25.0 软件用于数据统计分析。各组数据先用 Levene 法行方差齐性检验，如果方差齐，则采用单因素方差分析；如果方差不齐，则采用非参数检验。实验结果以平均值±标准差表示，P<0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 苏格木勒-7 对化疗性卵巢功能低下大鼠一般情况的影响实验结束时大鼠死亡 14只，其余鼠均存活。正常组大鼠毛色滑顺、精力旺盛；模型组大鼠皮毛不柔顺、精神萎靡；实验组大鼠皮毛较为光滑柔顺、精神较佳，其中苏-7中剂量组状态最佳。

2.2 实验前、后各组大鼠体重的变化实验前，各组大鼠体重无显著差异没有统计学意义(P>0.05)。实验结束后正常组体重明显增长较其他各组有显著性差异(P<0.05)，其中增长最少的是苏-7-2.0 g组，依次为模型组、苏-7-0.5 g组、补佳乐组、苏-7-1.0 g组。苏-7-1.0 g组与模型组及苏-7-2.0 g组比较体重有显著性差异(P<0.05)，其余均无显著性差异(P>0.05)，见表 1。这表明苏-7-2.0 g剂量给药时其胃肠道功能受影响，消化功能会下降，而进食量下降体重增长也最缓慢，也就是说随着剂量的加大它的胃肠道负荷增加，副反应也会增加。

2.3 实验结束后大鼠各脏器重量变化实验结束后，与正常组相比模型组的卵巢重量及脾脏重量明显下降(P<0.05)；苏-7-0.5 g组大鼠卵巢重量及脾脏重量与模型组相比明显增加(P<0.05)。其余组无明显差异(P>0.05)。说明低剂量苏-7-0.5 g可能具有保护卵巢和脾脏，提高免疫力的作用，中剂量苏-7-1.0 g可能具有增加体重作用。而苏-7-2.0 g组与CTX 组相比大鼠体重及各脏器均无显著差异(P>0.05)。通过对大鼠卵巢、肝、脾、肾以及子宫各个脏器重量的比较，发现肾脏、肝脏和子宫在各组之间无明显统计学差异(P>0.05)，但卵巢、脾脏在各组大鼠之间有明显统计学差异,见表 1。

表1 干预结束后各组大鼠体重，脏器重量比较

2.4 苏格木勒-7对化疗性卵巢功能低下大鼠性激素水平及AMH的影响检测各组大鼠血清中性激素水平和动情周期。苏-7 治疗 15天时，治疗组大鼠 AMH 水平显著下降(P<0.05)。中剂量苏-7-1.0 g组与模型组、补佳乐组比较 AMH 显著增高(P<0.01，P<0.05)；低剂量苏-7-0.5 g组与模型组比较AMH 也显著增高(P<0.05)，中剂量苏-7-1.0 g组作用较强。低剂量组能明显增高雌二醇(E2)水平，与其他 5 组相比均有显著差异(P<0.05)；模型组促卵泡激素(FSH)与正常组相比反而明显降低(P<0.01)，其他各组间均无显著差异；用苏-7 治疗 15天时提高 AMH 水平效果最佳，见表2。

表2 苏-7 治疗 15天的各组大鼠 AMH、E2、FSH 比较

苏-7 治疗 24天时，模型组与正常组比 AMH、E2、FSH 均无显著差异(P>0.05)；这与后期的卵泡形态学检测及卵泡计数时看到的治疗组的窦状卵泡数增高结果相吻合。苏-7 高、中剂量组分别与正常组及补佳乐组及模型组比 AMH 均增高，但无显著性差异(P>0.05);苏-7 中剂量组分别与补佳乐组及正常组及模型组比 E2 均增高，但无显著性差异(P>0.05)；FSH 六组间相比，均无显著差异(P>0.05)。这可能与此时模型的内分泌功能已经恢复，苏-7药效最佳时间已过有关，见表 3。

表3 苏-7 治疗24天的各组大鼠 AMH、E2、FSH 比较

2.5 苏格木勒-7 对化疗性卵巢功能低下大鼠动情周期的影响显微镜下正常动情周期各阶段的细胞特征及比例见图1。正常组大鼠表现出规律的动情周期，并且动情周期的每个阶段持续的时间都是正常的，化疗后大鼠动情周期均出现紊乱或无动情期，具体表现在 50%的大鼠动情周期紊乱，不规律，而 50%的大鼠无动情期；三种剂量的苏-7 治疗 13-22 天后大鼠 93.9%恢复正常动情期；最后实验结束时模型组41.6%大鼠停止动情 8 天后自然恢复动情期，58.4%的大鼠未能恢复动情期。和模型组相比三种剂量的苏-7 组大鼠恢复动情期(正常性周期)比率有显著差异(P<0.01)，见表4。

图1 大鼠不同动情周期阴道细胞图×100(注：A：动情前期 B：动情期 C:动情后期 D：动情间期)

表4 各组恢复动情期比率比较

统计结果表明，CTX对大鼠卵巢造成了损伤而出现卵巢早衰，三种剂量的苏-7治疗能保护或修复卵巢损伤，恢复大鼠卵巢的排卵，恢复正常的动情周期，因动情周期恢复正常，说明卵巢内分泌功能及生殖能力恢复正常。

2.6 苏格木勒-7对化疗性卵巢功能低下大鼠卵巢储备的影响本实验进一步研究了大鼠的卵巢储备以及卵泡的发育及形态学变化。进行了各级卵泡的数量统计，观察各组卵巢形态。

2.6.1各级卵泡计数情况 卵泡计数方法详见实验方法部分。由于CTX对生长卵泡的毒性损伤及始基卵泡池激活，CTX 后各级卵泡数目均减少，其中窦状卵泡与正常组比显著下降(P<0.05)，而闭锁卵泡显著增加(P<0.01)，卵果内分泌和生殖功能下降。在本研究中，CTX 组小鼠各级卵泡计数结合前述低雌激素水平和 AMH 下降及后面的生殖功能，说明成功建立了化疗致卵巢损伤模型。苏-7 高中低剂量组及补佳乐组大鼠窦状卵泡数目和模型组相比显著增高(P<0.05)，三种剂量苏-7 组大鼠闭锁卵泡数目与模型组相比显著减少(P<0.05)，而三种剂量苏-7 对原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡数目和正常组及 CTX 组相比未见统计学差异；见表5。

表5 治疗结束后各组大鼠卵巢各级卵泡数(每张切片)比较(个，

2.6.2各组卵巢形态变化 光镜下观察了各组卵巢的形态学改变。正常组：卵巢组织中皮质未见明显淋巴细胞浸润及纤维化；CTX 组：卵巢略萎缩，结构完整，各级卵泡数少，各级卵泡的颗粒细胞层次减少，部分卵泡发育不良，囊性扩张的卵泡增多，其内卵母细胞消失，皮质增厚，髓质少，间质内纤维结缔组织增生及灶状淋巴细胞浸润；中剂量苏-7组：卵巢结构正常，皮质略增厚，髓质少，见各级卵泡及黄体，间质内淋巴细胞浸润；高剂量苏-7组：卵巢结构正常，皮质略增厚，髓质少，见黄体及各级卵泡，其中窦状卵泡相对增多或窦状卵泡增生为主；低剂量苏-7组：卵巢结构正常，皮质略增厚，髓质少，间质血管充血，见黄体及各级卵泡，颗粒细胞层增多，窦状卵泡增生为主；补佳乐组：卵巢结构完整，各级卵泡数均少，皮质增厚，髓质少，间质内淋巴细胞浸润；见图2。

图2 显示各组大鼠卵巢形态(A-F依次显示正常、模型、苏-7-2.0、苏-7-1.0、苏-7-0.5、补佳乐组大鼠卵巢形态)

2.7 苏格木勒-7对化疗性卵巢功能低下大鼠生育能力的影响正常组大鼠生育率 100%，每窝新生鼠数量 11±1.0 只，而且全部生存且正常生长。模型组大鼠生育率 25%，每窝新生鼠数量 8.5±1.5 只，但新生鼠出生后 5-7 天全部死亡。苏-7 高剂量组生育率 50%，每窝新生鼠数量分别 8.5±1.5只，生存率 95%。苏-7 中剂量组生育率 100%，每窝新生鼠数量分别 8.5±1.5只，而且全部生存，正常生长。苏-7 低剂量组生育率 75%，每窝新生鼠数量分别 8.5±1.5只，生存率 96.2%。补佳乐组的生育率 50%，每窝新生鼠数量 9.8±1.0 只，但新生鼠出生后 5-7 天全部死亡；见表6。

表6 苏-7 对大鼠生殖功能的影响

3 讨论

卵巢是女性激素产生的重要器官，具有内分泌和生殖功能，对女性的内分泌生殖起着非常重要的作用，卵巢损伤引起的卵巢功能下降及卵巢功能提前衰退，将不可避免的过早绝经以及生殖能力的丧失[5]，前期诸多研究已经证实CTX能引起67%的生育期女性绝经[6-9]，还有一项重要的发现是，完整的化疗方案后只有0.6%的女性可以怀孕[10-11]，本研究模拟了卵巢功能下降及卵巢早衰。本实验发现,CTX组比正常组大鼠卵巢萎缩，卵巢重量明显下降，卵巢内分泌功能及生殖能力均明显下降，采用中低剂量的苏-7治疗之后，与CTX组及补佳乐组相比大鼠内分泌功能和生殖能力均显著提高，如：中低剂量的苏-7组血清雌二醇水平上升、AMH水平上升、大鼠动情周期恢复正常的比例显著增加、显微镜下卵巢组织窦状卵泡数明显增加、闭锁卵泡数下降、大鼠生育率及新生鼠生存率极显著提高。

通过本实验得出，该药具有保护化疗模型大鼠体重、卵巢及脾脏作用，能提高免疫力，保护卵巢功能。抵抗卵巢损伤及促进卵巢修复、促进卵泡生长发育成熟及排卵而恢复动情周期、提高生殖能力及提高新生鼠的生存能力。其中低剂量的苏-7防治化疗性卵巢功能低下作用优于补佳乐，而且低剂量苏-7疗效更佳。