真菌荧光染色法在皮肤浅部真菌感染中的应用研究

林宁宁,张路方,杨正生,杨会君,宋铁军,王丽兵

(秦皇岛市第一医院 皮肤科,河北 秦皇岛066000)

皮肤浅部真菌疾病的重要辅助检查手段为真菌直接镜检，其中常见的真菌镜检方法为浓度为10%的KOH湿片法[1]，虽然该诊断方法流程简易，然而其诊断准确率低，尤其是对甲癣的临床检出率更低，容易引起误诊或者漏诊[2-3]。近年来，真菌荧光染色法被广泛地用于皮肤浅部真菌检测之中。本研究通过对比10%的KOH湿片法与真菌荧光染色法检测皮肤浅部真菌的效果，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2017年7月至2020年7月皮肤科就诊的皮肤浅部真菌感染的114例患者作为观察组，其中男63例，女51例；年龄最小4岁，最大71岁，平均年龄(35.35±6.35)岁；类型：手足癣、体股癣、花斑糠疹及甲癣例数分别为42例、29例、20例及23例，所有标本一式两份。另外选择同期接受体检的健康者108例作为对照组，其中男59例、女49例；年龄最小6岁，最大69岁，平均(37.05±6.42)岁。

1.2 方法

1.2.1试剂及相关器材 (1)KOH溶液：选自于本院检验科配制的浓度为10%的KOH溶液；(2)荧光染液：主要包括KOH、伊文思蓝、荧光增白剂以及纯水等成分，均购自于北京索莱宝科技有限公司；(3)显微镜：选择上海寰熙医疗器械有限公司生产的XT-X-4B型显微镜(批准文号：苏食药监械(准)字2013第2221196号)，增加荧光模块。

1.2.2取材 使用蘸有浓度为75%乙醇的无菌棉签浸润及消毒皮损处，皮屑标本选择活动性皮损边缘位置的皮屑；甲屑标本选择增厚混黄伴鳞屑、空变病甲碎屑；毛发选择皮损内病发与毛根鳞屑。上述标本均一式两份，分别实施KOH湿片法与荧光染色法进行检测。

1.2.3KOH湿片法 向标本上滴加一定量的KOH溶液，并将盖玻片盖上，使用酒精灯进行加热，于显微镜(×200)下对视野进行观察。

1.2.4荧光染色法 于标本上滴加一定量的荧光染色液，将盖玻片盖上，染色3-5 s，将多余荧光染色溶液吸干净，于显微镜(×200)荧光模块下进行观察。

1.3 相关指标检测方法首先抽取2组入选对象清晨空腹状态下肘静脉血5.0 mL，3 000 rpm转速下离心5 min，分离血清，置于-80℃冰箱中，待测。采用酶联免疫吸附法对血清白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)进行测定，采用流式细胞学检测方法对T淋巴细胞亚群相关指标(CD3+、CD4+、CD8+)进行测定。

2 结果

2.1 2种检测方法检测效果对比2种检测方法检测效果分别见图1、2。KOH湿片法背景昏暗且杂乱，反差较小，真菌结构与杂质之间无法清晰鉴别；荧光染色法镜下能够清晰地观察到真菌轮廓，呈亮蓝色，菌丝也可明显观察到，菌丝与周围背景之间容易辨别。

图1 荧光染色法镜下真菌形态(×200) 图2 10%KOH 染色法镜下真菌形态(×200)

2.2 2种方法检测结果对比荧光染色法对手足癣、体股癣、花斑糠疹、甲癣检出率及总检出率分别为80.95%、96.55%、85.00%、91.30%及87.72%，均显著高于KOH湿片法(分别为45.24%、75.86%、45.00%、60.87%及56.14%)(P均<0.05)，见表1。

表1 2种方法检测结果比较[n(%)]

2.3 对照组与观察组外周血T淋巴细胞相关指标水平对比观察组外周血T淋巴细胞相关指标水平均显著低于对照组(P均<0.05)，见表2。

表2 两组外周血T淋巴细胞相关指标水平比较

2.4 对照组与观察组血清相关炎性因子水平对比观察组血清IL-2水平显著低于对照组(P均<0.05)，观察组血清IL-4及IL-10水平显著高于对照组(P均<0.05)，见表3。

表3 两组血清相关炎性因子水平比较

3 讨论

皮肤浅部真菌感染性皮肤病是临床上较常见的一种皮肤病，目前常见的真菌检测方法包括：荧光染色法与KOH湿片法等[4-5]。本研究结果显示荧光染色法对手足癣、体股癣、花斑糠疹、甲癣检出率及总检出率均分别显著高于KOH湿片法(P均<0.05)。杜鹏等[6]研究结果显示：荧光染色法对真菌阳性检测率为90.6%，显著高于10%KOH湿片法(67.4%)(P<0.05)；徐艳等[7]研究结果显示：荧光染色法对真菌阳性检测率为80.95%，显著高于10%KOH湿片法(55.23%)(P<0.05)。此外，在实际检测过程中，发现荧光染色法还能够对盖玻片及标本中可能存在微量的植物纤维素进行标记，并与真菌进行有效地区分及鉴别[8]。

细胞免疫通过对T淋巴细胞亚群各相关指标水平进行调节，促使机体保持稳定的免疫环境，本研究结果显示观察组外周血T淋巴细胞相关指标(CD3+、CD4+、CD8+)水平均显著低于对照组(P均<0.05)，表明当机体发生皮肤浅部真菌感染时，患者免疫水平显著下降。有研究显示[9-10]，机体细胞因子与T淋巴细胞功能之间存在紧密的关联性，当机体受到真菌等感染时，Th1/Th2淋巴细胞免疫会发生失衡，进而使促进免疫杀伤性细胞因子和免疫保护作用的细胞因子发生变化，本研究结果显示IL-2表达水平降低，而IL-4及IL-10表达水平升高，提示当机体发生浅部皮肤真菌感染时，Th1/Th2淋巴细胞免疫失衡。

综上所述，与10%KOH湿片法相比，真菌荧光染色法在皮肤浅部真菌检测中的应用效果更佳；且皮肤浅部真菌感染与T淋巴细胞及相关炎性因子表达之间存在紧密的关系。