冬荪优良菌种筛选研究

何忠国， 侯 俊， 王彩云， 肖 艳， 毕 宁

(1.毕节市林业科学研究所， 贵州 毕节 551700； 2.大方县扶贫开发办公室， 贵州 毕节 551700；3.毕节市中药研究所， 贵州 毕节 551700)

冬荪，学名白鬼笔(Phallusimpudicus)，又称无裙荪、竹下菌、鬼笔菌、竹菌，隶属鬼笔科、鬼笔属，主要分布在四川、贵州、安徽、云南、广东等省，营养价值丰富、口感松脆、味道鲜美，是著名的药食两用真菌[1-3]。冬荪含邻苯二甲酸二丁酯、多糖、紫苏烯、异山梨醇、硫化氢、乙醛、α-吡咯烷酮、二氢查尔酮、苯基巴豆油醛、9, 12-十八碳二烯酸乙酯、甲醛、苯乙醛、麦甾醇、烟酰胺、甲基硫醇、丙酸、氨基酸、糖醛酸聚糖等多种成分，以子实体、菌托和菌柄入药，具有活血、除湿、祛痛的功效，可用于抗凝血、治疗风湿、促进伤口愈合、消水肿等[4-5]。研究发现，冬荪还具有抗癌、抗氧化等活性[6]，有防病保健、提高机体免疫力的功效[7]。随着冬荪价值的发现及资源开发利用，冬荪已成为人们关注的焦点。

目前，冬荪在毕节大方、百里杜鹃管理区等县区已有较大面积的人工栽培，但由于栽培技术不规范，菌种混乱，导致冬荪产量不稳、质量不高，无法满足日益增长的市场需求。目前，对冬荪的研究报道主要集中于生物学特性及化学成分方面[7-10]，有关优良菌种资源筛选的研究报道极少。调查发现，许多农户通过采集冬荪竹蛋在室内分离后直接做成菌种用于生产，菌种质量良莠不齐，导致冬荪性状各异、产量不稳定。因此，针对冬荪种植中出现的品种杂多，优势资源少等问题，收集种植体量相对较大的冬荪资源进行研究，通过实验室分析、田间对比等方式筛选出品相好、品质优、产量高的冬荪品种加以推广，充分保障农户的收益，推动冬荪产业健康发展。

1 材料和方法

1.1 冬荪资源收集与初步评价

在毕节市大方县、百里杜鹃管理区等地区采集冬荪种植面积较大的各种冬荪菌蕾及子实体，根据冬荪子实体形状及商品性状将采集来的冬荪分为大杆蜂窝型、中杆肉质型、小杆精品型三类，每个资源采集40枚菌蕾，20株子实体，考察各类冬荪资源的菌蕾大小、子实体颜色、子实体长度、菌柄组织密度、子实体的折干率等性状，对冬荪资源进行初步评价，选择性状较佳的冬荪菌蕾进行分离，淘汰外观性状不好的冬荪资源。

1.2 室内分离培养

1.2.1培养基配制

以PDA培养基培养采集到的冬荪菌蕾、子实体。PDA培养基：马铃薯(去皮)200 g、葡萄糖20 g、琼脂5～7 g、定容至1 L，pH自然。制成PDA试管，置于高压蒸汽灭菌锅中121 ℃ 101 kPa的条件下灭菌25 min。试管移出倾斜放置在工作台上，冷却备用。

1.2.2外植体消毒

将挑选好的冬荪菌蕾用流水冲洗干净，于超净工作台中用75%酒精浸泡1.5 min，无菌水冲洗3遍，再用0.1%升汞消毒12 min，无菌水冲洗5遍，取出后用无菌吸水纸吸干菌蕾表面水分，备用。

1.2.3接 种

用解剖刀从菌蕾中间纵向切开，取菌蕾中菌柄雏形的底部生长点3～5 mm白色组织块，转接到试管培养基中，盖上棉塞，每个冬荪资源接种6支试管。

1.2.4培养、观察、记录

接种完成后置于25 ℃恒温培养箱中培养，定期观察试管中菌丝的长势、生长情况，做好记录。

1.3 提 纯

1.3.1培养基制备

将PDA培养基配好灭菌完成后，分装于无菌培养皿中。

1.3.2菌落培养

在无菌条件下，截取试管中3 mm长的菌丝转接到装有培养基的培养皿中，每个培养皿转接3个点，25 ℃下培养7 d，选留单菌落菌种。

1.3.3菌落筛选

经培养长出的单菌落需及时挑菌，选纯正、健壮的单菌落移入斜面试管内，一个菌落接一支斜面，待试管种长好后，再分别转接入原种培养基中培养至菌丝长满菌袋，然后进行栽培试验，反复比较各菌落的生产性能，择优留取。

1.4 原种培养

原种培养基：质量比为90%木屑+10%麦麸，含水量为70%～80%。

将配好的原种培养料装袋，经121 ℃ 101 kPa灭菌40 min，冷却后即可接种。每支试管接种转接原种6袋。接种完成后置于25 ℃的恒温条件下进行培养，直至菌丝长满整袋，备用。

1.5 田间栽培试验

将制成的原种用于田间栽培实验，观察出菇情况，统计分析各资源的产量、质量等。

1.5.1原材料准备

菌穴规格每穴0.3 m2(宽50 cm，长60 cm)，冬荪原种每穴1袋，木材30 kg·m-2，箭竹0.5 kg·m-2，麦麸0.5 kg·m-2、白糖0.5 kg·m-2，遮盖物适量。

1.5.2操作方法

采用随机区组设计，对分离转接得到的3个类型的冬荪原种进行田间栽培试验，每个品种试验9穴，穴与穴间隔2 m，避免造成菌丝混合。通过统计观察形成的菌蕾数量，出菇性状的一致性，单位面积产量等指标，进一步对所采集冬荪资源进行评价。

1.6 数据统计分析

用Excel 2007、SPSS 20.0软件对试验数据进行统计分析。

2 结果分析

2.1 冬荪资源初步评价

观察各冬荪资源的菌蕾大小、子实体的颜色、长度、菌柄组织密度和子实体折干率等农艺性状，并进行数据统计分析，详见表1。

由表1可知，大杆冬荪菌蕾均重225.80 g，菌蕾平均直径7.38 cm，菌托均厚0.44 cm，菌柄均长20.14 cm，鲜子实体均重49.5 g，平均92.4朵折干品500 g，折干率11.09%，该种冬荪菌柄粗壮，菌盖大(图1)，干品冬荪菌柄之间孔隙大、菌柄组织密度小，菌盖表层网孔大，外观性状不佳；中杆冬荪菌蕾均重192.80 g，菌蕾平均直径6.54 cm，菌托均厚0.48 cm，菌柄均长16.28 cm，鲜子实体均重45.34 g，平均120.8朵折干品500 g，折干率9.18%，此类冬荪折干率比大杆冬荪少1.91%，但其干品肉质肥厚、口感好，外观形状佳，商品性价较高；小杆冬荪菌蕾均重186.60 g，平均直径7.14 cm，菌托均厚0.42 cm，菌柄均长12.72 cm，鲜子实体均重32.74 g，平均174朵折干品500 g，折干率仅为8.83%，极显著低于大杆蜂窝型冬荪，此类冬荪外观形态较小，采收时耗费人工，但因其口感好、外观性状优良，仍有部分企业发展种植，将其做成精品。

图1 3种冬荪的形态特征

另外，观察发现子实体较大、菌柄较长的冬荪，其菌蕾重量也相对较大(见表1)，其中大杆蜂窝型冬荪菌蕾均重显著高于小杆精品型，大杆蜂窝型与中杆肉质型、中杆肉质型与小杆精品型的菌蕾平均单重之间无显著性差异；3种冬荪的菌蕾直径、菌托厚度无显著性差异，暗示其对冬荪外观性状及产量的影响不大。

表1 不同冬荪农艺性状统计

2.2 冬荪母种特性初筛分析

通过选择大杆、中杆、小杆冬荪成熟菌蕾进行组织分离，在相同的培养基及培养条件下观察试管中各冬荪菌丝的生长情况，主要观察内容及结果如表2所示。

表2 不同冬荪菌蕾组织分离培养情况

通过对分离的冬荪菌蕾在试管中菌丝性状及生长情况进行观察发现，三类菌种的萌发能力都较强，大杆蜂窝型冬荪菌丝长势最强，其次是中杆肉质型冬荪、小杆精品型冬荪；小杆精品型冬荪的满管时间短于中杆肉质型，大杆蜂窝型冬荪满管所需时间最长。三类菌种的菌丝均洁白无瑕，但大杆蜂窝型、小杆精品型冬荪的菌丝粗壮，中杆肉质型冬荪菌丝细小，大杆、中杆冬荪菌丝分支较多，小杆冬荪菌丝分支稍逊。

2.3 转接原种结果分析

将分离、纯化后的大杆、中杆、小杆3个类型的冬荪菌种下转接到相同的原种培养料中培养观察，发现3个类型的菌种在培养袋中菌丝的长势及萌发性均较好，转接20 d内中杆冬荪菌丝长势快于小杆和大杆冬荪(见图2)，但20 d后小杆冬荪菌丝生长加快。大杆、中杆、小杆菌种长满菌袋的时间分别为75、72、65 d，菌丝生长速度正常，菌丝长势均较好，未出现菌丝萎缩现象。

图2 不同类型冬荪原种生长情况

2.4 田间栽培试验

将大杆、中杆、小杆3个类型的冬荪原种进行田间栽培试验，观察记录各菌种的生长情况并进行统计分析，见表3。

表3 冬荪田间种植情况

由表3可知，3个类型冬荪在相同的栽培条件下，菌丝生长习性有所不同，原基形成的时间、菌蕾形成时间均有差异。原基形成时间在栽种后45～52 d之间，其中大杆蜂窝型冬荪的原基形成时间短，与中杆肉质型、小杆精品型冬荪原基形成时间差异极显著；菌蕾形成时间在栽种后72～78 d，其中大杆蜂窝型、小杆精品型冬荪的菌蕾形成时间较短，与中杆肉质型冬荪菌蕾形成时间差异极显著。单位面积菌蕾数量及单株冬荪的重量直接关系到单位面积冬荪的产量，单位面积内3个类型的菌蕾数量不同，其中大杆蜂窝型冬荪显著低于中杆肉质型冬荪，极显著低于小杆精品型冬荪；大杆蜂窝型、中杆肉质型、小杆精品型冬荪之间的单朵均重差异极显著。由于3种冬荪的单位面积菌蕾数量及单重差异，导致3种冬荪的折干率、单位面积鲜品产量、干品产量均不同，表现为大杆蜂窝型冬荪单位面积鲜品产量显著高于中杆肉质型冬荪，极显著高于小杆精品型冬荪，小杆精品型冬荪的单位面积鲜品产量最低。大杆蜂窝型冬荪的折干率显著高于中杆肉质型冬荪，极显著高于小杆精品型冬荪，小杆精品型冬荪的折干率最低，单位面积干品产量最低，且与大杆、中杆冬荪差异极显著。小杆精品型冬荪的菇期极显著长于大杆蜂窝型冬荪，显著长于中杆肉质型冬荪。

结合出菇特性、产量性状分析，大杆蜂窝型冬荪子实体均重、单位面积产量、折干率均高于其他两种类型，但其商品性状不好，中杆肉质型冬荪各方面表现都较好，小杆精品型冬荪在本次试验中的优势表现不明显。因此，在田间大面积种植时建议选择中杆肉质型冬荪为宜。

3 结论与讨论

3.1 结 论

通过在毕节市冬荪主栽区收集获得120枚菌蕾、60株子实体，进行外观性状考察、初步筛选、分离培养、纯化、室内初筛、原种转接、田间栽培试验等，筛选出适宜毕节地区种植的中杆肉质型冬荪，该菌种外观性状表现良好，出菇性状稳定，产量较高，折干率较好，其次为大杆蜂窝型冬荪，小杆精品型冬荪表现较差。

3.2 讨 论

衡量食用菌品种优劣的一个重要指标是菌丝生长速度和生长势。本研究发现，大杆蜂窝型冬荪菌丝萌发速度快，长势极强，在母种培养基中生长速度也较快，但是原种以及基质料中的生长速度并没有明显的优势，且产量及出菇性状不稳定；而菌丝生长较快、满瓶时间短的小杆精品型冬荪菌种在田间栽培实验中其农艺性状与产量表现并不好，说明菌丝体生长速度、生长势与产量性状之间的相关性不明显，不能用其预测产量，这与王振河等[11]、龚光禄等[12]、杜萍等[13]的研究结果相一致。另外，也反映出母种培养基上菌丝表现良好的菌种在原种、栽培种以及田间栽培种不一定能长势良好，因此也不能用母种菌丝的长势来推测原种、栽培种的长势。

冬荪等药食两用真菌的品种选育不仅要考虑产量、外观形状、产值，也要综合考虑化学成分以及药效、药用价值等。因此在下一步系统选育中，将深入研究各种冬荪的维生素、黄酮、多糖等化学成分含量，评估其药用价值，建立多指标综合评价体系，从而系统评价各冬荪菌种。