针刺疗法干预RANKL／OPG信号通路调控骨质疏松模型大鼠骨代谢平衡机制研究

2021-09-25丁小娟秦晓光郭小荣

康复学报 2021年4期

尹秦，潘虹，丁小娟，秦晓光，郭小荣

甘肃中医药大学附属医院，甘肃兰州730020

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是骨量减少、骨微结构退化导致的骨质变化、骨脆性增加，从而极易引发骨折的全身代谢性疾病［1］。研究表明，OP的发生是免疫系统、内分泌系统等多系统共同作用的结果［2-3］。基于中医学“肾主骨”“脾主运化”理论，OP与脾肾之气的强弱密切相关，脾胃健旺，则肾精气充足，骨骼强盛。研究表明，针刺能够改善骨微结构，促进成骨细胞生成［4］，针刺肾俞穴、三阴交穴、关元穴及足三里穴可培肾壮骨，固精培元［5-8］，这对骨质疏松的发生、发展具有重要影响，但相关机制并不明确。RANKL／OPG信号通路是由核因子Kappa B受体活化因子配体（receptor of activator nuclear factor-kB ligand，RANKL）和骨保护素（osteoprotegerin，OPG）构成。RANKL／OPG信号通路对破骨细胞的形成、分化和吸收具有一定的调节作用，但具体机制并未完全阐明［9-10］。因此，本研究通过切除雌性大鼠双侧卵巢的方法建立OP大鼠模型，给予电针刺激肾俞穴、三阴交穴、关元穴、足三里穴，旨在探究针刺对去卵巢大鼠RANKL／OPG信号通路的作用，并分析其对骨代谢平衡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雌性Wistar大鼠60只，3月龄，体质量（180±20）g，由甘肃中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（甘）2019-0001，适应性喂养1周后开始实验造模。本实验方案经甘肃中医药大学动物实验伦理委员会批准（批准号：2019010），实验过程及操作均遵守国家健康与医学研究委员会动物道德准则。

1.2 主要实验试剂及仪器

无菌针灸针（北京汉医医疗器械有限责任公司，规格：0.20 mm×25 mm）；HANS-200A电针仪（南京济生医疗科技有限公司）；戊酸雌二醇片（拜耳医药保健有限公司，规格：1 mg×21片，批号：H20160679）；RANKL抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-0747R-1）；OPG抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-0431R-1）；酶联免疫检测仪（美国BIO-RAD公司）；实验动物微型CT影像系统（德国西门子公司，型号：Inveon）；倒置相差荧光显微镜（日本Olympus公司）；骨密度仪（韩国Osteosys公司，型号：EXA-PRESTO）；骨特异性碱性磷酸酶（bone specific alkaline phosphatase，BALP）ELISA检测试剂盒、核结合因子-α1（core-binding factor α1，CBF-α1）ELISA检测试剂盒、Ⅰ型胶原羧基末端肽（cterminal typeⅠcollagen telopeptide，CTX-I）ELISA检测试剂盒、Ⅰ型前胶原氨基端前肽（procollagen typeⅠamino-terminal peptide，PINP）ELISA检测试剂盒、骨钙素（osteocalcin，OC）ELISA检测试剂盒均购自北京方程生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组与模型制备60只大鼠按照随机数字法分空白组、模型组、雌二醇组及针刺组，每组15只。适应性喂养1周后，除空白组外，其他大鼠均去除卵巢，建立OP型大鼠［11］，造模组大鼠骨密度较空白组显著降低时即造模成功［12］。

1.3.2 干预方法造模后进行为期12周的干预，参照“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”进行换算。空白组、模型组大鼠给予0.9% NaCl溶液50 μg／（kg·d）灌胃，雌二醇组给予戊酸雌二醇50 μg／（kg·d）灌胃，针刺组采用自制鼠袋固定大鼠，暴露针刺穴位，参照《实验针灸学》取穴方法选择肾俞穴、三阴交穴、关元穴、足三里穴［13］，将针灸针刺入穴位后，接电针仪，疏密波，刺激强度2 mA，频率2 Hz，15 min／次，1次／d，共治疗12周。4组大鼠均常规饲养，生长环境及饲养条件相同。

1.4 观察指标

1.4.1 骨代谢标志物含量测定经腹腔麻醉后处死大鼠，心脏取血2 mL，置于离心机中，离心半径10 cm，转速3 000 r／min，离心10 min，取上清液，ELISA法检测血清中BALP、CTX-Ⅰ、CBF-α1、PINP、OC含量水平。

1.4.2 骨密度及骨小梁微结构测定分离4组大鼠右侧股骨标本，置于Micro-CT下对远端干骺端进行扫描，设定扫描参数为：65 kV，384 mA，分辨率18 μm。所有标本从股骨远端生长板顶点至皮质部分去掉后为本次扫描兴趣区域（region of interest，ROI），提取图像资料，自带骨骼分析软件（Advanced Bone Analysis，ABA）测定骨组织相关计量学指标，包括：骨密度（bone mineral density，BMD）、相对骨体积（relative bone volume，BV／TV）、骨小梁厚度（trabecular bone thcikness，Tb.Th）、连接密度（connectivity density，Conn.D）、骨小梁分离度（trabecular separation，Tb.Sp）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、结构模型指数（structure model index，SMI）。所有CT操作、图像构建及统计分析均由同一组研究人员操作完成。

1.4.3 TUNEL法检测股骨远端细胞凋亡情况取4组大鼠股骨组织剪碎后置于4%多聚甲醛溶液内浸泡24 h，不同浓度乙醇按顺序脱水后，进行切片操作，脱蜡后将标本置于苏木精中进行染色15 min，最后脱水透明10 min，TUNEL试剂盒检测4组大鼠切片标本中细胞凋亡情况，激光共聚焦显微镜观察。

1.4.4 RT-PCR法检测RANKL／OPG mRNA表达提取4组大鼠下丘脑及股骨部分组织，使用RNA抽提试剂盒提取不同组大鼠股骨组织中总RNA，检测RNA纯度含量后用Takara逆转录试剂盒反转录获取cDNA，应用Primer 5.0设计引物序列，RT-PCR法检测4组大鼠不同组织中OPG和RANKL mRNA表达量，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参对照，采用2-ΔΔCt方法分析数据。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.4.5 免疫印迹法检测RANKL／OPG蛋白表达大鼠处死后，迅速取下丘脑及股骨远端的部分组织剪碎，加入RIPA裂解缓冲液放置在冰上30 min，分别提取4组大鼠相应组织中的总蛋白，然后使用BCA蛋白测定试剂盒测定各组大鼠皮肤中蛋白质的浓度。蛋白质用SDS-PAGE进行等量分离，然后移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PDVF）膜上，并置于4℃下添加一抗（1∶500）孵育过夜。洗涤后添加辣根过氧化物酶缀合的二抗（1∶500），常温下孵育2 h。使用ECL试剂进行显影，应用Quantity One软件分析蛋白相对表达水平。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料服从正态分布，数据以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐性时用LSD-t法进行检验，方差不齐采用Tamhane's T2进行检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组干预后骨密度及骨代谢标志物比较

与空白组比较，模型组、雌二醇组、针刺组BMD、BALP、CBF-α1、CTX-I、PINP、OC均明显低于空白组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，针刺组BMD、BALP、CBF-α1、CTX-I、PINP、OC均明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 4组干预后BMD及骨代谢标志物含量比较（±s）Table 2 Comparison of BMD and bone metabolic markers in four groups after intervention（±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。Note:Compared with the blank group,1)P＜0.05;Compared with the model group,2)P＜0.05.

2.2 4组干预后骨小梁微结构比较

与空白组比较，模型组BV／TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D均明显降低，Tb.Sp、SMI均明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，雌二醇组针刺组BV／TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D均明显升高，Tb.Sp、SMI均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 4组干预后骨小梁微结构比较（±s）Table 3 Comparison of trabecular microstructure in four groups after intervention（±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。Note:Compared with the blank group,1)P＜0.05;Compared with the model group,2)P＜0.05.

2.3 4组股骨远端细胞凋亡情况比较

TUNEL染色提示蓝色荧光为正常细胞核，绿色荧光为凋亡细胞。激光共聚焦显微镜观察显示，空白组大鼠骨组织正常，绿色荧光极少；与空白组比较，模型组凋亡细胞数量明显增加；与模型组比较，雌二醇组、针刺组干预后大鼠股骨远端细胞凋亡数量均明显减少。见图1。

图1 4组大鼠股骨远端细胞凋亡情况比较（×40）Figure 1 Comparison of apoptosis in distal femur in four groups（×40）

2.4 4组干预后下丘脑及股骨组织中OPG、RANKL mRNA表达量比较

与空白组比较，模型组下丘脑、股骨中OPG mRNA均明显降低，RANKL mRNA均明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，针刺组下丘脑、股骨中OPG mRNA均明显上升，RANKL mRNA均明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 4组干预后下丘脑及股骨组织中OPG、RANKL mRNA表达量比较（±s）Table 4 Comparison of OPG and RANKL mRNA expression in hypothalamus and femur in four groups after intervention（±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。Note:Compared with the blank group,1)P＜0.05;Compared with the model group,2)P＜0.05.

2.5 4组干预后下丘脑及股骨组织中OPG、RANKL蛋白表达量比较

与空白组比较，模型组下丘脑及股骨组织中OPG蛋白表达均明显降低，RANKL蛋白均明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，针刺组下丘脑、股骨中OPG蛋白表达均明显上升，RANKL蛋白表达均明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表5、图2。

图2 4组干预后下丘脑和股骨组织中OPG、RANKL蛋白表达量比较Figure 2 Comparison of OPG and RANKL protein expression in hypothalamus and femur in four groups after intervention

表5 4组干预后下丘脑及股骨组织中OPG、RANKL蛋白表达量比较（±s）Table 5 Comparison of OPG and RANKL protein expression in hypothalamus and femur in four groups after intervention（±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。Note:Compared with the blank group,1)P＜0.05;Compared with the model group,2)P＜0.05.

3 讨论

研究显示，OP发病与骨组织代谢异常、骨微循环障碍以及基因多态性等多因素有关［14］。随着人口老龄化加快和激素的过多使用，OP患病率呈现逐年增长趋势［15］。中医学将OP归于“骨痿”“骨枯”范畴，辨证论治多从肾、脾等脏腑入手。张景岳［16］指出：“水谷之海先天为之主，精血之海后天为之资……先天不足者，后天培养之，亦可居其强半。”说明肾精气充足与脾胃功能密切相关，脾胃健旺，则水谷精微化源充盛，骨骼强盛。

中医藏象学说认为“肾精生髓，髓通于脑”“诸髓者，皆属于脑”。可见古代医家早已认识到脑、肾、骨三者密切的联系。故当脑生理活动异常时，肾主骨生髓之功能也可能异常，甚至可发展至骨痿。有研究认为，OP是由神经系统、内分泌系统以及免疫系统功能紊乱导致的骨代谢异常［17］，而下丘脑是系统调节的主要调控中心［18］。“肾藏精”在整体层次的主要体现就是对下丘脑的调控作用［19］。随着个体衰老，机体脾肾渐衰，从而出现“脾肾亏虚”的各种表现，进而导致OP发生发展［20］。因此，临床亟需寻找有效的方法干预OP，并探讨其可能的作用机制。

3.1 针刺可改善OP模型大鼠骨密度，调节骨代谢水平

骨密度是临床检测骨质疏松变化的重要指标。本研究结果显示，与空白组比较，模型组大鼠的BMD及骨代谢标志物等含量明显降低，这表明去卵巢大鼠造模后骨量出现丢失，这与骨质疏松的病理表现相符。与模型组比较，针刺组大鼠骨密度含量明显增加，骨代谢相关标志物水平明显改善，骨小梁微结构指标明显改善，这提示针刺可改善OP模型大鼠骨密度，调节骨代谢水平。这与乔梁等［21-22］研究结果一致。PINP作为Ⅰ型前胶原细胞外分泌产物是骨形成的敏感指标，CTX-Ⅰ是骨吸收过程中Ⅰ型胶原释放入血的产物。PINP、CTX-Ⅰ是诊断骨质疏松症的特异性指标［23-24］。针刺足三里、三阴交、肾俞、关元等穴位可使血液中PINP及CTX-Ⅰ含量明显增加，从而提高Ⅰ型胶原的合成速率，促进成骨细胞活动和骨吸收。CBF-α1属于runt结构域基因家族的转录因子，由成骨细胞特异性表达，是决定成骨细胞分化的重要因子。OC主要由成骨细胞、成牙质细胞合成，作为成骨细胞分泌的特殊非胶原蛋白，其含量变化可用于监测骨发育以及骨代谢情况，在调节骨钙代谢中起重要作用［25］。针刺足三里、三阴交、肾俞、关元等穴位可提高CBF-α1和OC含量，这有助于调节成骨细胞分化，调控骨细胞的功能因子表达，促进骨骼形成和发育［26］。

3.2 针刺调节OP模型大鼠骨代谢平衡可能与RANKL／OPG信号通路调控有关

下丘脑在骨代谢的调控过程中发挥重要作用，而RANKL／OPG信号通路是骨代谢过程中重要的信号通路之一。本研究结果显示，OP模型大鼠下丘脑及股骨远端组织中OPG表达下降，而RANKL表达升高，这提示下丘脑可协同调控股骨组织中RANKL／OPG信号通路表达，间接促进骨吸收过程。本研究结果还发现，大鼠造模后RANKL／OPG蛋白和mRNA在下丘脑及股骨远端组织中表达含量发生明显变化，但经针刺干预后，OP大鼠下丘脑及股骨组织中OPG mRNA和蛋白表达量明显上升，RANKL mRNA和蛋白表达量明显下降，这提示针刺能够调节OP大鼠RANKL／OPG信号通路的表达，这与魏振朴等［27-28］研究结果一致。维持RANKL／OPG信号通路平衡，能够调控破骨细胞的生成，控制骨代谢，而在骨代谢过程中下丘脑能够分泌多种信号因子来调节骨吸收标志物并参与骨重建的过程，骨碱性磷酸酶（BALP）是其中主要的成骨细胞表型标志物之一［29-30］。BALP可诱导成骨细胞分泌RANKL转导因子，促使组织中的核因子κB（NF-κB）受体活化因子配基调控骨吸收［31］。OPG是由成骨细胞分泌的RANKL饵受体（NF-κB受体活化因子配体），RANK是RANKL的唯一受体，在破骨细胞前体细胞、成熟的破骨细胞和软骨细胞上均有表达［32］。在BALP影响下，OPG与RANK竞争并结合RANKL，拮抗RANKL-RANK表面相关蛋白的结合，从而导致破骨细胞的分化、成熟能力降低，促使破骨细胞凋亡，抑制骨吸收［33］。针刺足三里、三阴交、肾俞、关元等穴位可提高BALP含量，促进RANKL／OPG信号通路表达，促进骨吸收作用，增强骨小梁结构强度，提高骨密度，从而改善骨微结构，进而影响骨质疏松发病进程［34］。