茶藨子木层孔菌化学成分及其抗肿瘤活性

鲍梦雨， 曹宸贞， 李媛媛， 刘玉红， 马 艳

(山东中医药大学药学院，山东 济南 250355)

针层孔菌属为担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、锈革孔菌科[1]，现有研究表明，该属真菌含有多糖、甾体类、萜类、黄酮类等活性成分，具有抗肿瘤、增强免疫、抗氧化等生物活性，呈现很好的市场开发前景[2]。

茶藨子木层孔菌Phellinusribis，为针层孔菌属药用真菌，寄生于山楂、梨树的活体根茎上[3]，主要分布于中国、日本、韩国。目前，国内外已经从茶藨子木层孔菌中分离得到多糖类、色素类、神经酰胺类、苯骈呋喃类成分[4-6]，并且发现它们有抗肿瘤、增强免疫、神经保护等活性[7-9]。为了进一步开发利用茶藨子木层孔菌资源，本实验对其甲醇提取物进行分离纯化，从中得到4个化合物，均为苯乙烯基吡喃酮衍生物。其中，化合物1～4均为首次从本真菌中分离得到，对肝癌HepG2的增殖均显示抑制作用，以1最显著。

1 材料

JMS-700高分辨质谱仪(日本捷欧路公司)；Inova-600型核磁共振仪(美国Varian公司)；半制备液相色谱仪(日本分光Jasco公司)；柱色谱硅胶(63～210 μm，日本关东化学株式会社)；薄层色谱硅胶GF254(德国Merck公司)；Sephadex LH-20(美国GE Healthcare公司)；Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ半制备色谱柱(10 mm×250 mm，5 μm，日本Nacalai公司)。所用试剂均为分析纯或色谱纯。

茶藨子木层孔菌采集于济南历城山区，由山东中医药大学生药学教研室徐凌川教授鉴定为正品。

2 提取与分离

取1.8 kg茶藨子木层孔菌的干燥粗粉，用甲醇室温浸提30 d，提取液减压浓缩得浸膏20 g，浸膏用硅胶柱色谱进行初步分离，用二氯甲烷、二氯甲烷-乙酸乙酯(9∶1、1∶1)、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇(9∶1、7∶3、1∶1)依次洗脱，合并后得到7个流分Fr.1～7。

Fr.4经Sephadex LH-20(甲醇)得9个部分(Fr.4.1～Fr.4.9)，Fr.4.5经制备HPLC甲醇-水(1∶1)分离纯化，得组分Fr.4.5.6，再经制备薄层氯仿-甲醇(7∶3)，得化合物4(1.5 mg)。流分Fr.3用Sephadex LH-20(甲醇)分离，合并得到8个组分Fr.3.1～Fr.3.8，Fr.3.5用硅胶柱色谱氯仿-甲醇(20∶1)处理，再经HPLC柱甲醇-水(65∶35)制备，得化合物1(5 mg)；Fr.3.7经HPLC制备纯化，用丙酮-水(32∶68，1%TFA)洗脱，得组分Fr.3.7.4(4.4 mg), 溶于500 μL甲醇，静置72 h，上清为化合物2(1.2 mg)，沉淀为化合物3(1.8 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：黄色粉末(甲醇)，分子式C23H16O8。HRFAB-MSm/z: 421.089 8[M+H]+。1H-NMR (600 MHz，丙酮-d6)δ: 7.36 (1H，d，J=2.2 Hz，H-6′)，7.35 (1H，d，J=16.1 Hz，H-7)，7.26 (1H，dd，J=8.3，2.1 Hz，H-10′)，7.19 (1H，d，J=1.9 Hz，H-9)，7.06 (1H，dd，J=8.3，1.9 Hz，H-13)，6.93 (1H，d，J=8.3 Hz，H-9′)，6.90 (1H，s，H-4)，6.88 (1H，d，J=8.3 Hz，H-12)，6.83 (1H，d，J=15.9 Hz，H-6)，2.67(3H，s，1′-CH3)；13C-NMR (150 MHz，丙酮-d6)δ:158.3 (C-1)，109.2 (C-2)，161.1(C-3)，95.7 (C-4)，159.2 (C-5)，117.5 (C-6)，135.5 (C-7)，128.9 (C-8)，114.6 (C-9)，146.4 (C-10)，147.9 (C-11)，116.5 (C-12)，121.6 (C-13)，32.2 (C-1′)，196.9 (C-2′)，119.4 (C-3′)，154.8 (C-4′)，121.3 (C-5′)，115.3 (C-6′)，145.9 (C-7′)，148.4 (C-8′)，116.3 (C-9′)，120.9 (C-10′)。以上数据与文献[10]基本一致，故鉴定为inoscavin C。

化合物2：深黄色无定型粉末，分子式C21H14O7。HRFAB-MSm/z: 401.064 6[M+Na]+。1H-NMR (600 MHz，CD3OD)δ: 7.30 (1H，d，J=15.9 Hz，H-2′)，7.20 (1H，d，J=2.1 Hz，H-2″)，7.16 (1H，dd，J=8.2，2.1 Hz，H-6″)，7.04 (1H，d，J=2.1 Hz，H-4′)，6.96 (1H，s，H-3)，6.94 (1H，dd，J=8.5，2.1 Hz，H-8′)，6.83(1H，d，J=8.2 Hz，H-5″)，6.83 (1H，s，H-7)，6.77 (1H，d，J=8.2 Hz，H-7′)，6.70 (1H，d，J=15.8 Hz，H-1′)；13C-NMR (150 MHz，CD3OD)δ:158.3 (C-2)，100.3 (C-3)，161.3 (C-4)，158.6 (C-6)，96.5 (C-7)，117.4 (C-1′)，135.5 (C-2′)，129.3 (C-3′)，114.7 (C-4′)，146.8 (C-5′)，148.3 (C-6′)，116.6 (C-7′)，121.6 (C-8′)，122.4 (C-1″)，112.7 (C-2″)，146.9 (C-3″)，148.0 (C-4″)，116.8 (C-5″)，117.9 (C-6″)，112.3 (C-3a)，162.7 (C-7a)。以上数据与文献[11]基本一致，故鉴定为phellifuropyranone A。

化合物3：黄色粉末，分子式C20H12O8。HRFAB-MSm/z: 381.060 3[M+H]+。1H-NMR (500 MHz，CD3OD)δ:8.41 (1H，s，H-7)，7.60 (1H，s， H-10)，7.42 (1H，d，J=15.9 Hz，H-2′)，7.08 (1H，d，J=1.9 Hz，H-4′)，6.99 (1H，dd，J=8.5，1.9 Hz，H-8′)，6.79(1H，d，J=8.3 Hz，H-7′)，6.70 (1H，d，J=15.8 Hz，H-1′)，6.52 (1H，s，H-4)；13C-NMR (125 MHz，CD3OD)δ:162.0 (C-1)，160.5 (C-3)，99.9 (C-4)，161.2 (C-6)，115.4 (C-7)，148.2(C-8)，155.2 (C-9)，111.8 (C-10)，116.3 (C-1′)，138.1 (C-2′)，128.8 (C-3′)，114.9 (C-4′)，146.9 (C-5′)，149.1 (C-6′)，116.6 (C-7′)，122.3 (C-8′)，162.7 (C-4a)，112.6 (C-6a)，129.1 (C-10a)，100.6 (C-10b)。以上数据与文献[12]基本一致，故鉴定为phelligridin D。

化合物4：橙黄色粉末，分子式C25H18O9。HRFAB-MSm/z: 463.103 8[M+H]+。1H-NMR (600 MHz，CD3OD)δ: 7.43 (1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，7.08 (1H，d，J=1.9 Hz，H-9)，6.99 (1H，dd，J=8.8，1.9 Hz，H-13)，6.79 (1H，d，J=8.2 Hz，H-12)，6.74 (1H，d，J=15.2 Hz，H-6)，6.74 (1H，d，J=8.9 Hz，H-10′)，6.70(1H，d，J=2.1 Hz，H-7′)，6.58 (1H，dd，J=8.3，2.1 Hz，H-11′)，6.49 (1H，s，H-4)，5.65 (1H，s，H-5′)，5.57 (1H，s，H-2′)，1.97 (3H，s，1′-CH3)；13C-NMR (150 MHz，CD3OD)δ:160.6 (C-1)，99.5 (C-2)，176.8 (C-3)，95.5 (C-4)，167.0 (C-5)，117.3 (C-6)，139.9 (C-7)，128.5 (C-8)，115.1 (C-9)，146.9 (C-10)，149.4 (C-11)，116.6 (C-12)，122.6 (C-13)，192.9 (C-1′)，105.1 (C-2′)，203.1 (C-3′)，94.5 (C-4′)，95.9 (C-5′)，123.2 (C-6′)，115.5 (C-7′)，146.3 (C-8′)，147.8 (C-9′)，115.9(C-10′)，120.2(C-11′)，16.6(C-1′CH3)。以上数据与文献[13]基本一致，故鉴定为inoscavin A。

4 抗肿瘤活性筛选

参照文献[14]方法，测定化合物1～4在不同浓度下对肝癌HepG2细胞的抑制率。实验组每孔加入20 μL样品溶液，终浓度分别为5、10、20、40、80、160 μmol/L，同时设空白对照组、阳性对照组(5-Fu，终浓度为80 μmol/L)，每组重复6次，结果见图1。由此可知，化合物1～4对肝癌HepG2细胞增殖的抑制活性在5～160 μmol/L浓度范围内呈现出较好的剂量依赖性；在浓度为160 μmol/L时，各化合物对HepG2细胞的抑制率分别为71.8%、63.1%、45.2%、56.5%，即1抑制作用较强。

图1 各化合物对HepG2细胞的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of various compounds on HepG2 cells

5 讨论

茶藨子木层孔菌在中国、韩国作为传统药物被用于抗肿瘤[15]，疗效确切，以往对其抗肿瘤活性的研究主要集中在水溶性大分子多糖类成分[16]，关于其小分子成分及抗肿瘤活性筛选的报道较少。本实验在前期研究的基础上，从茶藨子木层孔菌中分离鉴定出了4个苯乙烯基吡喃酮类化合物，均为首次从该真菌中分离得到。

据文献报道，化合物1、4具有清除自由基和抑制Hela229细胞增殖的潜力[17]；化合物2、3对小鼠黑色素瘤和人肺癌细胞株的增殖有抑制作用，两者GI50值分别为5.6～31.3、7.1～22.6 μmol/L[11]。另外，化合物4有强效脂氧合酶抑制活性[18]，化合物3还具有抗炎、抗氧化作用[19]，证明茶藨子木层孔菌具有较好的药物开发前景。

本研究显示，化合物1～4均具有明显的抑制肝癌HepG2细胞增殖的活性，并在5～160 μmol/L浓度范围内呈现出较好的剂量依赖性。其中，化合物1较化合物2对肝癌HepG2细胞的抑制作用强，可能是前者、结构多1个醛基；化合物4对肝癌HepG2细胞的抑制作用较化合物2弱，其结构多1个五元环，可能破坏了呋喃并吡喃酮环的平面性，后期可进一步考察其构效关系。本实验丰富了茶藨子木层孔菌活性成分的研究，并为苯乙烯基吡喃酮类成分抗肿瘤的作用机制研究提供了参考，也为后期该真菌药理活性研究提供了依据。