环磷酰胺致小鼠免疫器官损伤的组织学研究

曹楠，八晓敏，洪龙胜，邓媛，李婉雁，黄运茂，田允波，许丹宁*

（1.仲恺农业工程学院 动物科技学院，广东 广州510225；2.广东省水禽健康养殖重点实验室，广东 广州510225；3.广东省农业科学院 动物卫生研究所，广东 广州510640）

环磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）在20世纪60年代开始广泛用于治疗自身免疫性疾病及作为肿瘤疾病的化疗用药，但过量使用时，会产生剂量依赖性的毒性临床表现［1］。CTX对细胞的毒性作用主要表现为骨髓抑制和白细胞、血小板下降，阻断淋巴母细胞生长发育、T/B细胞的分化过程，因此，对机体细胞和体液免疫都有抑制作用。通常在用药后7～14 d达到高峰，停药15 d后机体慢慢自行恢复［2］。CTX在体内代谢过程中，不仅直接作用于细胞产生严重的毒性作用，还对胸腺、脾脏及骨髓等免疫器官有明显的损伤，科研人员利用CTX的毒性作用制备免疫抑制动物模型，可以获得良好的免疫抑制效果，从而用于不同目的的科学探索试验中［3，4］。

有研究发现，CTX可以引起小鼠白细胞数量降低，造成小鼠胸腺、脾脏和骨髓组织及细胞的损伤［5］。付晶等［6］发现，CTX可导致雏鸡肝脏组织细胞线粒体明显受损，并发生细胞凋亡。也有研究证明了通过不同方式给予小鼠CTX都可以引起小鼠骨髓微核率逐渐增大［7］。然而目前对于CTX的研究多集中在对各个免疫器官的影响，缺乏对于免疫器官的系统性、整体性研究。此外，CTX的使用剂量、作用时间、给药方式等的不同，对机体免疫功能的抑制效果也不同。据此，本研究选用低、中、高3种不同浓度的CTX，连续3 d对昆明小鼠进行腹腔注射，建立免疫抑制小鼠模型，观察在不同浓度的CTX作用下，小鼠的胸腺、脾脏、白细胞及骨髓组织的病理损伤变化，为建立合适的免疫抑制小鼠模型提供组织学的试验依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物

32只5周龄雌性SPF级昆明小鼠，购自南方医科大学实验动物中心。

1.2 试验材料

注射用CTX：国药准字H14023686，山西普德药业股份有限公司；HE染色液及Giemsa染色液：珠海贝索生物技术有限公司；多聚甲醛、戊二醛：广州化学试剂厂。

1.3 试验方法

1.3.1 试验分组及设计

将32只雌性昆明小鼠随机分为4组，每组8只，分别为对照组（C组）、CTXⅠ组、CTXⅡ组、CTXⅢ组，组间小鼠平均体重无显著性差异（P＞0.05）。对照组小鼠腹腔注射灭菌生理盐水0.5 mL，CTXⅠ组、CTXⅡ组、CTXⅢ组小鼠分别按40、100、160 mg·kg-1·BW-1剂量腹腔注射CTX溶液，连续3 d，注射后第7天采集样品并保存。整个试验期严格按照昆明小鼠饲养管理标准操作规程［GB14925-2010］进行饲养。

1.3.2 体重及胸腺、脾脏指数测定

采集样品前，小鼠禁食12 h，称重后安乐死小鼠，快速摘取小鼠胸腺及脾脏，称重记录，按公式：器官指数=器官重（mg）/体重（g），计算胸腺和脾脏指数。

1.3.3 胸腺、脾脏和骨髓组织结构观察

预冷剪刀及尖镊迅速摘取小鼠胸腺及脾脏组织，修成1 mm3左右的近方形组织块，置于2.5%戊二醛溶液并在4℃保存，送广州金域医学检验中心制备透射电镜切片并拍照。取小鼠胸腺、脾脏及左侧股骨，修成3～5 mm3左右组织块，置于多聚甲醛溶液中保存，制备切片进行H.E.染色，成片于普通光学显微镜下观察并拍照。

1.3.4 外周血白细胞比例测定

剪除小鼠尾尖采血滴于洁净载玻片一侧，另取载玻片进行推片，使血膜呈舌状，自然干燥后进行Giemsa染色，油镜下观察白细胞形态，每组每只小鼠取4张血涂片，每张血涂片计数200个白细胞，分别计算中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞比例（%）。

1.3.5 骨髓PCE微核率测定

安乐死小鼠后，摘取小鼠胸骨及右侧股骨，将胸骨纵向切开，用PBS将每一节胸骨中的骨髓冲洗至离心管中，股骨剪断两端骨骺，用PBS将股骨中的骨髓冲洗至离心管中，混匀后骨髓悬浊液1000 r·min-1离心5 min后弃去上清液，取20μL用于制作骨髓涂片，自然晾干后滴加甲醇固定5 min，Giemsa染色。每组每只小鼠计数1000个多染红细胞（PCE）微核率，以千分率（‰）为单位。

1.4 数据分析

试验数据用SPSS 20.0软件进行处理，选择单因素方差分析LDS多重比较法分析组间数据，以平均值±标准差（Mean±S.D.）表示，P＜0.05时认为显著性差异；组织石蜡切片、血涂片及骨髓涂片采用CCD显微成像分析系统进行拍照分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的CTX对小鼠体重、胸腺、脾脏指数及组织结构的影响

3个CTX组间小鼠的体重无显著性差异（P＞0.05））（表1），与对照组相比，CTX组小鼠的体重和胸腺指数显著降低（P＜0.05），CTXⅡ组和CTXⅢ组胸腺指数显著低于CTXⅠ组（P＜0.05）。脾脏指数随CTX浓度的升高而降低，但差异不显著（P＞0.05）。

表1 各组小鼠胸腺、脾脏指数及体重变化Table 1 Variations of thymus and spleen index and body weight of mouse in each group

对照组小鼠胸腺发育良好，皮质、髓质区分界明显，皮质层较厚，胸腺细胞排列密集有序，髓质区可见胸腺小体，胸腺细胞数量较多。CTXⅠ组小鼠胸腺皮质层厚度与对照组接近，低倍镜下与对照组无差异，髓质区可见胸腺小体，但胸腺细胞着色较浅（1000X）。CTXⅡ组和CTXⅢ组小鼠胸腺结构紊乱，皮髓分界模糊，皮质区面积缩小，胸腺细胞排列疏松，形态差异较大，髓质区偶见胸腺小体，成熟的胸腺细胞数量明显减少，死亡细胞增多，纤维细胞增多，纤维增生现象明显（图1）。

图1 各组小鼠的胸腺组织结构（H.E.染色，上100×，下1000×）Fig.1 Thymus tissue structure of mouse in each group（H.E.staining，upper 100×，lower 1000×）

超微结构观察可见对照组小鼠胸腺细胞形态良好，排列整齐，核质比较大，核内异染色质团块较多，核仁清晰可见，细胞器简单，最常见线粒体结构（图2）。CTXⅠ组小鼠胸腺细胞有明显的病理变化，主要以凋亡为主，也可见自噬小体，胞核内异染色质浓缩、边集和中集，细胞内有髓样小体，线粒体肿胀。CTXⅡ组中坏死细胞数量剧增，凋亡小体也随处可见，大部分胸腺细胞胞核萎缩，异染色质结块聚集，常染色质缺失，线粒体肿胀变形。CTXⅢ组是损伤最严重，除了上述病理表现外，大部分胸腺细胞胞浆内出现大量脂滴和脂褐素沉积，表明细胞处于濒死崩解阶段。

图2 各组小鼠的胸腺超微结构（TEM，上1500×，下10000×）Fig.2 The ultrastructure of the thymus of mice in each group（TEM，upper1500×，lower10000×）

对照组小鼠脾脏结构完整，白髓、红髓分界清晰，白髓部分动脉周围淋巴鞘结构发达，少见脾小结，淋巴细胞密度大，排列整齐，中央动脉结构良好（图3）。CTX组小鼠脾脏白髓处动脉周围淋巴鞘随着CTX浓度升高而逐渐变薄，淋巴细胞着色变浅，排列稀疏，白髓和红髓难以区分。CTXⅠ组中央动脉管壁疏松，内皮细胞肿胀，CTXⅡ、CTXⅢ组小鼠脾脏红髓区出现髓外造血现象，有许多散在的巨核系前体细胞，核高度分叶，胞浆丰富性。

图3 各组小鼠的脾脏组织结构（H.E.染色，上100×，下1000×）Fig.3 Spleen tissue structure of mice in each group（H.E.staining，upper 100×，lower 1000×）

超微结构可见对照组小鼠脾脏中各类细胞形态良好，未见异常现象，成熟的淋巴细胞较多，还可见浆细胞、单核细胞、中性粒细胞等（图4）。CTX组小鼠脾脏细胞密度比对照组小，排列不规则，也主要以凋亡为主，胞核萎缩，异染色质高度聚集，细胞体积缩小，细胞浆和细胞器病理变化不如胸腺细胞明显，CTXⅡ组和CTXⅢ组凋亡及坏死的细胞明显多于CTXⅠ组，并出现较多的巨核系前体细胞。

图4 各组小鼠的脾脏超微结构（TEM，上1500×，下10000×）Fig.4 The ultrastructure of the spleen of mice in each group（TEM，upper 1500×，lower 10000×）

2.2 不同浓度的CTX对小鼠白细胞比例、PCE微核率及骨髓结构的影响

表2结果显示，与对照组相比，3个CTX组小鼠血液中性粒细胞比例显著升高（P＜0.05），淋巴细胞比例显著下降（P＜0.05），CTXⅢ组小鼠的中性粒细胞比例显著高于CTXⅠ组和CTXⅡ组（P＜0.05），淋巴细胞比例显著低于这2组（P＜0.05）。单核细胞比例在4组间没有显著性差异（P＞0.05）。从图5可以看出，对照组小鼠白细胞形态正常，中性粒细胞胞核一般为2～4叶，处于成熟状态，淋巴细胞核质比大，体积小，单核细胞核分叶情况极少，绝大部分呈现蚕豆形或肾型。CTX组中随着CTX浓度的升高，中性粒细胞核分叶减少，杆状核增多，单核细胞分叶增多，淋巴细胞核质比逐渐降低。CTXⅢ组中死亡的中性粒细胞数量最多，表现为细胞膜破裂，胞浆内容物溢出，仅有核存在。CTX组小鼠骨髓PCE微核率均显著高于对照组，CTX组之间均差异显著（P＜0.05）（图6）。

图5 各组小鼠的中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞形态（Giemsa染色，1000×）Fig.5 The morphology of neutrophils，lymphocytes and monocytes in each group of mice（Giemsa stain，1000×）

图6 各组小鼠的骨髓PCE微核（Giemsa染色，1000×）Fig.6 Bone marrow PCE micronucleus of mice in each group（Giemsa stain，1000×）

表2 各组小鼠3种白细胞比例及骨髓PCE微核率变化Table 2 Changes of the ratio of 3 types of white blood cells and the rate of PCE micronucleus in mice

骨髓切片显示，对照组小鼠股骨骨结构正常，骨髓丰满，细胞密集，髓性造血干细胞中的粒系、红系及巨核细胞系发育良好，可见成熟的淋巴细胞（图7）。CTXⅠ组小鼠骨组织与对照组相近，仅骨髓细胞数量稍少，其余结构未见明显异常，骨髓内细胞形态及种类也能保持正常。CTXⅡ、CTXⅢ组小鼠骨组织与对照组相比有显著差异，骨髓内细胞数量急剧下降，各细胞系的细胞核淡染，发育不良，粒系细胞量相对增多，成熟的淋巴细胞数量明显减少，出现大量红细胞，并有纤维增生现象。

图7 各组小鼠的股骨组织结构（H.E.染色）Fig.7 Femur tissue structure of mice in each group（H.E.staining）

3 讨论

3.1 CTX对小鼠胸腺、脾脏组织结构的影响

CTX是经典的肿瘤化疗药物，具有强烈的骨髓抑制及免疫抑制作用，在自身免疫性疾病和器官移植中广泛应用［8］，也是制备免疫抑制动物模型最常用的药物，但应根据实验目的，对CTX的用法及用量进行条件探索。本试验连续3 d对小鼠腹腔注射不同浓度的CTX，7 d后观察到所有CTX组小鼠体重显著减轻。胸腺指数随CTX浓度的升高而显著降低，但脾脏指数与对照组无显著性差异，可能是因为胸腺作为中枢免疫器官，内部绝大部分是处在不同发育时期的胸腺细胞，CTX可直接抑制胸腺细胞的正常发育，导致大量胸腺细胞死亡［9］，又因骨髓抑制作用，淋巴祖细胞迁入胸腺途径受阻，胸腺细胞得不到及时的补充，因此在CTX作用下，胸腺重量减轻更显著。脾脏是外周免疫器官，内部免疫细胞主要是可执行功能的成熟细胞，而CTX主要对处于增殖周期阶段的细胞具有强烈的毒性作用［10］。与此同时，脾脏又具备储血、滤血及髓外造血功能，所以各CTX组小鼠脾脏指数与对照组差异不显著。

组织学结果显示，CTX对小鼠胸腺和脾脏造成的共同损伤主要表现在内部细胞数量明显减少、大量细胞凋亡和坏死。在光学显微镜下，CTXⅠ组小鼠的胸腺和脾脏基本能维持正常结构，CTXⅡ组和CTXⅢ组小鼠胸腺和脾脏结构破坏严重，胸腺有严重的纤维增生现象，脾脏白髓区动脉周围淋巴鞘变薄，Francesco等［11］指出，CTX对脾脏中CD8+T细胞的清除效力在50%左右，而骨髓中未被激活的CD8+T淋巴细胞数量则未受到CTX的影响，这项研究从细胞实验角度解释了本实验中CTXⅡ组和CTXⅢ组小鼠动脉周围淋巴鞘变薄的现象。此外，脾脏红髓区发生髓外造血，出现大量巨核系前体细胞，属于三系髓外造血类型，出现髓外造血与CTX造成的小鼠骨髓抑制密切相关，并具有剂量依赖性。髓外造血指的是发生于骨髓腔以外的器官或组织的造血增生现象，当具有造血功能的骨髓出现功能障碍时，脾脏、肝脏及淋巴结会恢复胚胎时期的造血功能，一般啮齿动物自发的髓外造血较其他动物品系更常见，特别是小鼠［12］。产生髓外造血的生理依据是肝脾器官在幼龄期本身具备造血功能，成年后依然保留有造血干细胞，当机体出现骨髓造血障碍、骨髓抑制、炎症、损伤及修复时，会激发脾脏和肝脏出现代偿性的髓外造血，也有研究认为髓外造血的发生不是肝脾内造血干细胞发挥作用，而是来源于骨髓造血干细胞经血液循环到达肝脾定居而产生［13，14］。本试验电镜结果显示，CTXⅠ组小鼠胸腺和脾脏内部的细胞凋亡数量明显高于对照组，CTXⅡ组和CTXⅢ组的坏死细胞数量显著增多，其中胸腺细胞被破坏的更加严重，细胞器病理损伤严重，濒死和死亡细胞数量高于脾脏内部细胞，而脾脏以细胞凋亡为主。Victoria等［15］用200 mg·kg-1·BW-1CTX对大鼠肌肉注射7 d后，观察到大鼠胸腺中出现大量浆细胞和活性巨噬细胞，淋巴细胞的有丝分裂活性降低，这与本试验结果差异较大，可能CTX的剂量及试验动物品种的不同对胸腺造成的损伤也不同，在大剂量长期应用CTX的情况下，不仅直接损害胸腺内淋巴细胞，还可能诱导巨噬细胞及浆细胞发生迁移。包汇慧等［16］采用10 mg·kg-1·BW-1CTX经口染毒大鼠连续28 d后，观察胸腺和脾脏组织结构发现，胸腺和脾脏结缔组织增生，胸腺皮质部淋巴细胞排空，脾细胞早期凋亡和坏死细胞显著升高，是制备脾细胞免疫抑制模型的最适剂量和用法。这与本试验得出的结果略有差异，而杨敬等［17］采用100 mg·kg-1·BW-1CTX连续腹腔注射4 d，注射后d 4观察Balb/c小鼠脾脏的组织结构则得出了与本试验近似的结论。说明在低浓度的CTX长期作用下，脾脏并未发生髓外造血，而主要表现为免疫细胞的缺失并发结缔组织增生的病理现象，而中、高浓度的CTX短期作用下，骨髓造血干细胞缺失较多，脾脏启动造血功能，发生髓外造血，这是机体自我修复的表现。上述结果表明，CTX使用剂量及作用时间对胸腺和脾脏的病理组织学的影响差异很大，与CTX的致病机理及试验动物自身的调节能力密切相关。

3.2 CTX对小鼠外周血白细胞比例及骨髓PCE微核率的影响

小鼠股骨石蜡切片结果发现，CTXⅠ组小鼠股骨结构也与对照组接近，同样在CTX浓度超过100 mg·kg-1·BW-1时出现明显的病理损伤，髓性造血干细胞的数量显著下降。CTX是一种烷化剂，对造血干细胞的影响很大，因其醛脱氢酶含量高而对巨核细胞祖细胞的影响更大，因此在高浓度CTX作用下，骨髓单个核细胞（Bone Marrow Mononuclear Cells，BMNC）中的巨核系细胞减少最多［18］。He等［19］在研究中采用腹腔注射100 mg·kg-1CTX制备化学损伤小鼠模型，检测BMNC中的蛋白酪氨酸磷酸酶-1（SHP-1）及凋亡相关基因Bax的mRNA和蛋白表达，发现与对照组相比，CTX组SHP-1和Bax的表达明显上调，SHP-1是JAK/STAT信号通路的负向调节因子，能显著抑制这条途径，从而影响造血干细胞的生长、增殖、分化和凋亡过程。而凋亡关键基因Bax表达上调，导致凋亡细胞数量增多，因此，CTX可能是通过影响上述基因的表达，从而对骨髓细胞产生强烈的抑 制 作 用。曹 胜 男 等［20］采 用20 mg·kg-1·BW-1CTX灌胃连续处理小鼠14 d，检测小鼠股骨干重较对照组减少28%，股骨横径减少9.64%，骨钙含量下降32.54%，差异极显著，这项研究表明，CTX不仅对骨髓细胞产生了强烈的抑制作用，还可能对骨细胞产生抑制作用，进而使骨胶原的合成和分泌减少，导致钙盐沉积减少，骨钙流失，造成骨质疏松。

血涂片和骨髓涂片结果显示，与对照组相比，CTX组小鼠中性粒细胞比例显著升高，淋巴细胞比例显著下降，单核细胞比例变化不明显。且在相同倍数视野下观察发现，CTX组小鼠的白细胞数量显著低于对照组，且CTXⅡ组和CTXⅢ组小鼠的各类白细胞形态均与对照组有显著差异，濒死白细胞数量增多。也有研究人员指出，连续5 d给予昆明小鼠腹腔注射50 mg·kg-1·BW-1CTX，12 h后检测发现小鼠的淋巴细胞百分比较对照组显著升高，而中性粒细胞百分比和单核细胞百分比均显著下降［21］。田嘉军等［22］采用经口灌胃法给予昆明小鼠100 mg·kg-1·BW-1的CTX连续3 d，24 h后检测小鼠的中性粒细胞百分比为45.26%，淋巴细胞百分比为50.18%，单核细胞百分比为0.62%。上述试验结果均在24 h内检测各类白细胞百分比，得出了与本研究不同的结论，由此可推测，CTX作用后对小鼠白细胞比例的影响是一个动态变化的过程，在白细胞绝对数值显著下降的情况下，初期中性粒细胞比例显著下降，淋巴细胞比例上升，而到后期淋巴细胞的比例显著下降，中性粒细胞百分比显著上升。

此外，CTX组小鼠的骨髓PCE微核率也显著升高，分别比对照组高出2.69、8.44、11.20倍，研究 结 果 与 付少 华 及Lyris等 相一 致［23，24］。王 文蔚等［25］研究发现，给予小鼠一次性腹腔注射60～90 mg·kg-1·BW-1CTX溶液后，36～48 h时就发现骨髓PCE微核率的显著升高，表明低浓度的CTX单次作用就可对骨髓红系细胞的发育产生明显的损伤。因此，骨髓PCE微核率指标可用来判断药物或毒物对细胞染色体的损伤程度，微核出现的频率取决于染色体断裂或丢失的速率以及细胞分裂的速率，虽然几乎所有正在分裂的细胞都可产生微核，但在任何有诱导染色体畸变的药物作用下，骨髓PCE微核率会显著上升［26］。本试验结果也进一步证实了CTX对骨髓造血干细胞的强烈抑制作用。

4 结论

综上所述，本文从病理组织学的角度，对昆明小鼠的胸腺、脾脏、骨组织及血液中白细胞比例和骨髓PCE微核率指标进行了检测，发现100 mg·kg-1·BW-1的CTX可显著降低小鼠体重及胸腺指数，导致胸腺结构紊乱，纤维增生，胸腺细胞凋亡及大量坏死，脾脏白髓区动脉周围淋巴鞘结构消失，发生髓外造血，脾细胞凋亡数量剧增，骨髓造血干细胞数量减少，血液中白细胞比例失衡，骨髓PCE微核率显著升高，是造模的最佳注射剂量。