hENT-1表达水平对胰腺癌吉西他滨辅助化疗的影响

陈垚宇，王 喆，王 昭，荆 鑫，张 强

（1.珠海市人民医院普通外科，广东 珠海 519000；2.内蒙古医科大学附属医院肝胆胰脾外科）

全世界每年因为胰腺癌而死亡的人数大于200，000例[1]。我国最新的统计报告指出，每年发病人数接近10万人，其中男性和女性分别约为5.4万人和4.1万人。而死亡人数更达到了8.4万，男性约为4.8万和女性约为3.6万[2]。其进展快且隐匿，许多病人发病早期没有任何症状，一旦出现腹痛、黄疸、贫血等症状时，病情可能达到晚期，从而丧失根治性手术机会，超过半数患者无法接受根治手术[3]。由于该病恶性度高、预后极差，为防止癌细胞残留或癌症复发，术后应采取辅助化疗。临床上通常选用较5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）副作用少的吉西他滨（Gemcitabine，GEM）进行辅助化疗[4，5]。随着临床应用，人们逐渐发现GEM辅助化疗个体间的效果不尽相同。一些胰腺癌组织对GEM化疗敏感性欠佳，可能导致部分病人仅获得有限的效果。因为hENT-1是介导GEM进入肿瘤细胞的主要运载体，所以部分学者认为其表达水平可能影响GEM辅助化疗敏感性[6]。

人类平衡型核苷转运体-1（Human equilibrative nucleoside transporter-1，hENT-1）是具有疏水α-螺旋结构的跨膜蛋白[7，8]。该转运体除在许多正常组织中分布外，亦在肿瘤中差异表达[21～25]。它不仅帮助转运人体基本生理生化反应过程中所需物质，而且具备了转运核苷类药物的能力。亲水性核苷类药物GEM不能通过被动扩散的方式穿过细胞膜，所以需要依赖hENT-1进入胞浆[9]，以发挥抑制肿瘤生长效果。

理论上GEM可显著提高胰腺癌病人的总生存期及无病生存期。但临床上其疗效却有着明显的差异，GEM敏感性差是延长病人OS和DFS的主要困难。至此，全世界学者们都在研究造成其敏感性不一的原因。可惜，时至今日，有关hENT-1是否影响胰腺癌GEM辅助化疗敏感性的研究结论并未形成统一。如Farrell[6]认为hENT-1表达水平与胰腺癌GEM辅助化疗敏感性相联系，可影响病人的OS以及DFS。但是，Poplin[10]等学者则认为hENT1低表达对GEM化疗敏感性无影响，病人之间的OS未见明显差异。由于国内有关hENT-1的研究缺乏，且此研究区域暂无有关文献，故此次研究具有一定意义。

笔者对近5年附属医院胰腺癌GEM辅助化疗的患者采取回顾性分析，并经免疫组织化学手段测定胰腺癌组织中hENT1的表达水平，最后对相应预后情况作出对比分析。

1 试剂与仪器

1.1 试剂

PBS缓冲液、DAB显色液、中性树胶、乙醇、修复液、苏木素染色剂、兔多克隆抗hENT-1抗体等。

1.2 仪器

切片机、烤片机、展片台、光学显微镜、显微镜摄像系统、冰箱、温箱。

1.3 组织标本

近5年附属医院55例胰腺导管腺癌切片。

2 病例收集及观察指标

2.1 实验对象

入选标准：（1）行胰腺癌根治术后，病理学诊断为导管腺癌；（2）未行新辅助放、化疗；（3）经GEM为主辅助化疗；（4）满足免疫组织化学手段标本；（5）临床资料，如年龄、性别、民族、饮酒情况、肿瘤位置、肿瘤大小、病理级别、TNM分期、术式无明显缺失；（6）无较为严重的并发症；（7）随访至2020.01.01。

排除标准：（1）患有严重心、肺、脑、肾、免疫缺陷等基础疾病；（2）肿瘤晚期或TxNxM1，无法行根治术；（3）病人失访或拒绝规律随访病情。

2.2 观察指标

（1）经免疫组化后hENT-1的染色强度、范围；（2）总体生存期和无病生存期；（3）年龄、性别、民族等情况；（4）肿瘤位置及直径、术式、病理级别、TNM分期。

3 实验方法

3.1 制作胰腺癌切片

3.2 免疫组化染色

按顺序进行：脱蜡→水化→抗原修复→去除内源性过氧化物酶→封闭→孵育一抗→孵育二抗→DAB显色→苏木素复染→分化→返蓝→脱水→透明→封片。

3.3 免疫组织化学评分

将染色强度分为4级，利用同一切片中淋巴细胞的着色度进行标准化，3分即强着色，肿瘤细胞的染色程度高于淋巴细胞；2分即中等着色，两种细胞染色程度一致；1分即浅着色，肿瘤细胞的染色程度弱于淋巴细胞；0分即无着色。而染色范围计分即评估单张切片范围内着色的肿瘤细胞占该切片总肿瘤细胞的比例，4分：＞50%阳性，3分：26%～50%阳性；2分：11%～25%阳性；1分：≤10%阳性；0分：细胞呈阴性或比例＜1%。最终，hENT-1染色水平评分由上述两项相加，强阳性（++）：≥7分；阳性（+）：5～6分；弱阳性（+-）：3～4分；阴性（-）：＜2分。低表达组由阴性及弱阳性组组成，高表达组则由阳性及强阳性组组成。

4 医学统计学分析

利用统计学软件SPSS 20.0分析，正态分布数值以（±s）表示，计量资料采用方差分析或t检验。而计数资料应用卡方检验以及Fisher精确检验（当期望值＜5时）。以Kaplan-Meier生存曲线分析OS和DFS与hENT-1表达水平的相关性。病人的独立预后因素分别以Log-rank检验及Cox regression模型进行分析。检验水准为α＝0.05，P＜0.05即差异存在统计学意义。

5 结果

5.1 hENT-1表达水平与病人预后的单因素生存分析

经Kaplan-Meier分析后示，hENT-1高表达组与低表达组的中位OS分别是20个月对10个月（见图1），而DFS是15个月对6个月（见图2）。hENT-1高表达组的OS及DFS明显优于低表达组。

图1 hENT-1表达水平与OS的KM生存曲线

图2 hENT-1表达水平与DFS的KM生存曲线

5.2 hENT-1表达水平与病人预后的多因素生存分析

经Cox regression分析临床资料中的变量后，其结果表明OS的独立预后因素是hENT-1表达水平、病理级别和淋巴转移情况（P＜0.05）。DFS的独立预后因素是hENT-1表达水平和病理级别（P＜0.05）。

5.3 临床资料与hENT-1表达水平

hENT-1表达水平分别与计量资料（病人年龄、肿瘤直径）经t检验后，暂无统计学意义（P＞0.05），以及与计数资料（性别、民族、饮酒情况、肿瘤位置和病理等级）行χ2检验差异无统计学意义（P＞0.05）。因此，临床资料与hENT-1蛋白表达水平无相关性，暂不能认为其对hENT-1表达水平有影响。

6 讨论

指南指出[12]，GEM是胰腺癌辅助化疗的一线药物。基本生命功能平稳的病人术后应积极使用GEM辅助化疗。但是，化疗前未知GEM化疗敏感情况时，很难制订最佳的化疗方案。若有标记物能够预测胰腺肿瘤对GEM辅助化疗敏感性，可为化疗药物选择提供思路，从而制订个体治疗方案。本研究发现hENT-1高表达病人比低表达病人使用GEM辅助化疗生存期更长、敏感性更高，对GEM耐药的可能性更低。而且，在GEM辅助化疗下，其OS的独立预后因素是hENT-1表达水平、病理级别和淋巴转移情况（P＜0.05）。而DFS的独立预后因素是hENT-1表达水平和病理级别（P＜0.05）。因此根据hENT-1表达水平预测胰腺癌术后GEM辅助化疗效果有一定意义。但是，过往研究表明有争议发生。Farell[6]等学者发现GEM组hENT-1表达与病人OS和DFS相关，而5-FU组则未见相关性，但该实验将免疫组化染色结果分为3个等级，即＞50%肿瘤细胞染色的为高染色；＜50%染色者为无染色；介于两者之间的为低染色。但上述分级方法忽略了染色强度深浅的情况。几年后，Marechal等[13]也发现接受GEM化疗的病人，hENT-1高表达与更长的生存期显著相关（HR 0.34，P＜0.05），而未接受辅助化疗的病人以及其他化疗组无上述情况。而且，hENT-1是GEM辅助化疗预后的独立影响因素。由于胰腺癌复发率高，术后基本生命功能平稳的病人鲜有不进行辅助化疗的，且不接受辅助化疗病人无法追踪，所以本研究无法构建非化疗组，该方向研究需等待下一阶段进行。Marechal[13]及Oba[15]都认为hENT-1高表达病人更应选择GEM行辅助化疗，因为高表达者获益更多。对于hENT-1低表达的病人，有学者[14]认为不应采取GEM作为化疗方案的主要药物，因为低表达的病人术后使用GEM化疗所获得的效果欠佳。而5-FU相比之下具有更好的获益，并且ESPAC-3试验[14]亦证实这一点。

虽然hENT-1表达水平与胰腺癌GEM辅助化疗疗效具有相关性的观点获得以上研究支持，但仍有不少学者对此作出反对。如Fisher等[16]指出在GEM辅助化疗中，hENT-1高表达水平者与OS无关，无法作为主要标记物来预测该药化疗敏感性。Ormanns等[11]则 利 用AIO-PK0104的 临 床 资 料 进 行两次实验，所有结果均无法支持hENT-1可以作为预测性生物标记物。除此之外，一些学者[17，18]甚至怀疑hENT-1表达与GEM敏感性存在差异可能与免疫组化中所选择的hENT-1抗体种类有关，如SP120兔抗体对测定的hENT-1表达水平可能存在缺陷。针对该情况，Kalloger等[19]认为10D7G2单克隆抗体和SP120多克隆抗体，均可检测出hENT-1的表达水平。而且，两者可相互补充某种有意义的信息，令研究对象分层更加全面，如疗效的分层。

本研究探讨胰腺癌hENT-1表达水平对吉西他滨辅助化疗的影响，所入组的病人均接受胰腺癌根治术，并排除了其他明显影响生存期的疾病。笔者认为同时使用10D7G2单克隆抗体和SP120多克隆抗体进行测定可以更全面地对病人hENT-1表达水平作出准确的评估。但是由于10D7G2国内无大量生产，以至获取困难，故本次研究仅选用SP120多克隆抗体。本次染色评分综合染色强度及范围，可大大减少因显色条件差而产生的误判，临床上采用该方法具有确切意义。本次研究所覆盖到的范围有限，无法对全国不同地区人群展开研究。今后仍需各位学者进行更深一步探研。

7 结论

hENT-1表达水平与GEM辅助化疗预后相关。hENT-1高表达的病人比低表达者有更长的OS和DFS，说明高表达者的GEM敏感性更高。检测hENT-1表达水平具有预测吉西他滨疗效的意义。hENT-1表达水平和病理级别共同影响病人的OS和DFS，却互不牵涉，其机制暂不明确。年龄、性别、肿瘤位置及大小、术式、TNM分期等暂未发现对hENT-1表达水平造成影响。