NRF2启动子区基因多态性与世居喀什地区维吾尔族COPD相关性研究

李 黎

（喀什地区第一人民医院呼吸与危重症医学科，新疆 喀什 844000）

慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease，COPD）属于临床较为常见的慢性呼吸系统疾病。据报道，近年来其发病率在全球范围内仍呈逐年上升趋势，预计到2030年将居于全球致死原因第3位[1]。而近年来我国新疆南疆地区COPD患病率也呈逐年增长趋势，尤其作为维吾尔族人群聚居地的新疆喀什地区，COPD患病率普遍较高，且中老年人高发，与该地区特殊的地域特点及干燥寒冷的气候环境有关[2]。而COPD发病机制复杂，不仅与环境因素有关，还与氧化-抗氧化失衡导致的氧化应激、遗传易感性等有关[3]。核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，NRF2）作为细胞氧化应激反应的关键因子，参与肺脏大多数抗氧化蛋白和细胞保护基因表达调控过程，可预防炎症所致氧化应激损伤；一旦机体受到外界刺激而发生氧化损伤时，NRF2会与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1解离，并转移到细胞核内结合抗氧化反应元件启动子区，调控下游氧化应激相关基因表达，在COPD氧化-抗氧化平衡中意义重大[4]。有研究表明，COPD病人肺组织NRF2表达明显下调，而启动子区调控NRF2表达及其稳定性，故这些区域的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）变化可能会引起NRF2表达改变，并影响其对疾病的易感性[5]。但目前尚无报道分析NRF2启动子区基因多态性与喀什地区维吾尔族COPD的相关性。为此，本研究通过探讨NRF2基因rs6706649位点多态性与世居喀什地区维吾尔族COPD的遗传易感性，旨在揭示世居喀什的维吾尔族COPD病人疾病发生的相关分子生物学机制，为其基因诊断和治疗提供新思路，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017-09～2019-09喀什地区第一人民医院呼吸科门诊、急诊收治的世居喀什维吾尔族COPD病人200例纳入研究对象，设为病例组；另外选取同期收治的体检健康志愿者300例纳入研究对象，设为对照组。病例组纳入标准：（1）符合2016年最新慢性阻塞性肺疾病全球倡议（Global initiative for chronic obstructive lung disease，GOLD）指 南的诊断标准[6]，吸入支气管扩张剂后，第1秒用力呼气容积占用力肺活量的百分比（forced expiratory volume in the first second is the percentage of forced vital capacity，FEV1/FVC）＜70%，经询问病史、胸部CT或X线胸片等检查确诊；（2）年龄＞18岁；（3）民族均为维吾尔族（世居喀什地区且无外族通婚史）。对照组纳入标准：（1）所有受试者均为喀什地区第一人民医院维吾尔族健康体检者；（2）肺功能检查FEV1/FVC＞80%；最大呼气中期流速、50%用力呼气流速、75%用力呼气流速中任意两项占预计值百分比＞65%；（3）X线胸片或胸部CT提示未发现肺气肿、慢性支气管炎等表现；（4）年龄＞18岁；（5）民族均为维吾尔族（世居喀什地区且无外族通婚史）。排除标准：（1）合并其他肺疾病史，如肺纤维化、哮喘、支气管扩张症、肺结核等；（2）既往有一个或一个以上肺叶切除史，肺容量显著降低；（3）急性心肌梗死；（4）合并进展期恶性肿瘤；（5）处于严重感染、创伤等严重应急状态；（6）疑似或确实存在药物滥用及酒精依赖史；（7）妊娠、哺乳期妇女。本研究符合《赫尔辛基宣言》，且研究对象均对本研究知情同意。

1.2 方法

1.2.1 研究方法 统计两组基础资料信息，包括年龄、性别、身体质量指数（body mass index，BMI）、居住地区、文化程度及有无吸烟史、饮酒史、COPD家族史、个人呼吸道疾病史、有害气体或粉尘接触史，观察两组NRF2基因rs6706649位点多态性，并分析世居喀什地区维吾尔族人群COPD发生的独立危险因素。

1.2.2 NRF2基因rs6706649位点多态性检测（1）主要仪器与试剂。主要仪器包括UNOⅡ48型聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）扩增仪（德国Biometra公司）；Nanodrop 2000超微量分光光度计（美国Thermo公司）；AM100电子分析天平（北京赛多利斯公司）；微型离心机（德国Effendorf公司）；其他仪器如超高速离心机、高压灭菌器、-80℃冰箱等均购自日本Sanyo公司。主要试剂包括全血基因组DNA提取试剂盒（荷兰Qiagen公司）；沙丁胺醇气雾剂（西班牙Glaxo Wellcome S.A公司）；其他试剂如无水乙醇、异丙醇等均由宝生物工程（大连）有限公司提供。（2）检测方法。所有研究对象抽取2 mL空腹静脉血，乙二胺四乙酸抗凝，按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书快速提取DNA，保存于-80℃超低温冰箱。使用Nanodrop 2000微量分光光度计行DNA浓度和纯度测定，采用260 nm与280 nm处的吸光度比值（A260/A280）及260 nm与230 nm的吸光度比值（A260/A230）评价DNA纯度，确保A260/A280值处在1.8～2.0范围内，A260/A230值大于2.0。使用Sequenom公司引物设计软件MassARRAY Assay Design 3.0设计待测rs 6706649位点的PCR扩增引物与单碱基延伸引物，并在生物工程（上海）有限公司合成。PCR引物：上游5'-ATCTGT GGCGTGGTGGCTGCGCTTTGG-3'，下 游5'-AGCTC GTGTTCGCAGTCACCCTGAGCG-3'。利用多重PCR技术对该位点基因序列进行扩增。PCR反应条件：94℃4 min；94℃20 s，56℃30 s，72℃1 min，共计45个循环；72℃3 min；4℃保持。于PCR仪上放置PCR反应板，启动PCR反应。待PCR反应结束后用SAP（Shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶）处理PCR产物。碱性磷酸酶处理结束后行单碱基延伸反应，完毕后利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基因分型技术，测定基因分型结果。NRF2基因rs6706649位点有3种基因型，即为CC、CT、TT基因型；存在2个等位基因，即等位基因C和等位基因T。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0进行统计学数据分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，采用t检验；计数资料采用率或百分比表示，采用χ2检验；单因素分析有意义的因素赋值后引入多因素Logistic分析，检验水准为α＝0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 影响世居喀什地区维吾尔族人群COPD发生的单因素分析

两组性别、BMI、居住地区、文化程度对比差异无统计学意义（P＞0.05）；病例组年龄≥60岁、吸烟史、饮酒史、COPD家族史、个人呼吸道疾病史、有害气体或粉尘接触史、携带NRF2基因rs6706649位点CT和TT基因型及T等位基因占比显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。

2.2 影响世居喀什地区维吾尔族人群COPD发生的多因素Logistic回归分析

将世居喀什地区维吾尔族人群COPD作为因变量，将表1中有统计学意义的项目作为自变量，纳入Logistic回归分析模型，行量化赋值（见表2）。多因素Logistic回归分析显示，年龄、吸烟史、饮酒史、COPD家族史、个人呼吸道疾病史、有害气体或粉尘接触史及携带NRF2基因rs6706649位点CT、TT基因型及T等位基因是世居喀什地区维吾尔族COPD发生的独立危险因素（P＜0.05）（见表3）。

3 讨论

COPD是最为常见的慢性呼吸系统疾病，其患病率在不同地区存在很大差异，如湖北省COPD的患病率为8.92%，而重庆市渝中区COPD患病率为12.50%，推测可能与不同地区环境危险因素的暴露率差异有关[7，8]。目前COPD发病机制尚不明确，主要认为与蛋白酶与抗蛋白酶失衡、炎症反应、氧化与抗氧化失衡、自身免疫、细胞凋亡等机制有关，其中氧化应激被认为是COPD发病的关键促发因素，氧化应激损伤不仅可直接诱发肺组织和气道损伤，还可导致蛋白酶-抗蛋白酶失衡，诱导炎症反应的发生；而NRF2属细胞氧化应激反应的关键因子，在COPD的发生及发展中发挥着重要作用[9]。新疆维吾尔自治区处于我国西北边陲，秋冬季寒冷、少雪、少雨，空气较干燥，属COPD高发区。虽然年龄、性别、民族等个体因素已被临床研究证实与COPD的发病密切相关，但目前鲜有报道分析世居喀什地区维吾尔族COPD发生的独立危险因素，关于性别、居住地区、饮酒史、COPD家族史、个人呼吸道疾病史、有害气体或粉尘接触史等因素与世居喀什地区维吾尔族COPD发病的相关性尚未完全明确，且关于NRF2启动子区基因多态性与世居喀什地区维吾尔族COPD的相关性鲜有报道[10]。因此，本研究对此展开初步探讨。

本研究结果显示，年龄、吸烟史、饮酒史、COPD家族史、个人呼吸道疾病史、有害气体或粉尘接触史是世居喀什地区维吾尔族COPD发生的独立危险因素，与既往报道[11，12]相似。推测原因，随着年龄的增长，机体各个器官功能逐渐衰退，会减少肺泡与肺弹力纤维弹性，致使胸廓顺应性降低、肺功能下降，故高龄本身会引发COPD。吸烟时产生的苯并芘、尼古丁等多种有害物质，会反复刺激气道及肺泡，引起支气管黏膜下细胞肥大和增生，致使粘膜下腺体分泌亢进，同时会引起气道上皮细胞损伤，促使纤毛运动减弱、气道阻力加重。另外，香烟燃烧产生的烟雾可形成较多的氧自由基，促使细胞分泌破坏能力较强的中性粒细胞弹性蛋白酶，致使肺弹力纤维分解、肺泡壁破坏，最终形成肺气肿，诱发COPD。而COPD属一种受环境因素与遗传因素共同作用的多基因疾病，其发病具有家族聚集性，故COPD家族史也是COPD发生的独立危险因素。此外，个人呼吸道疾病史也是增加COPD患病风险的因素之一，既往有呼吸道疾病史可能会影响肺功能，加速COPD进程，推测与肺组织损伤、结构改变和肺顺应性降低有关。同时，有害气体或粉尘接触史也是COPD的重要危险因素，有害气体或职业性呼吸道粉尘的慢性暴露可诱发气道阻塞，引起COPD。

本研究结果显示，携带NRF2基因rs6706649位点CT、TT基因型及T等位基因是世居喀什地区维吾尔族COPD发生的独立危险因素，与Cui W等[13]报道相似。NRF2广泛表达于肾脏、肺脏、肌肉等多个组织，对多种抗氧化物酶基因表达具有调控作用，参与COPD的发生及发展[14]。生理情况下NRF2会结合胞浆蛋白分子伴侣Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1而存在于细胞浆中，活性呈相对抑制状态；一旦受外界刺激而出现氧化损伤时，其会与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1解离，转移至细胞核内，并与抗氧化反应元件启动子区结合，调节下游抗氧化应激相关基因表达，维护机体免受氧化应激损伤。Kubo H等[15]研究表明，NRF2基因敲除的小鼠吸烟所致肺气肿较野生型小鼠更为严重，可更早进展为肺气肿，出现更加严重的肺组织损害，提示NRF2参与了对抗机体氧化应激的过程。Chi Y等[16]报道COPD病人支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞内NRF2 mRNA表达水平较正常人低，提示NRF2参与COPD的发病过程。NRF2参与的主要细胞信号传导通路有蛋白激酶、活化B细胞的核因子K-轻链增强子、磷酸肌醇-3-激酶、促分裂原活化蛋白激酶等细胞信号转导途径，推测NRF2可能通过参与这些途径诱导COPD的发生。而NRF2基因上存在诸多SNP位点。付聪丽等[17]报道NRF2单核苷酸多态性与COPD肺功能FEV1水平相关。张宝华等[18]认为rs6706649可能是阿尔茨海默病发病风险相关的SNP位点。笔者推测，携带NRF2基因rs6706649位点CT、TT基因型及T等位基因与世居喀什地区维吾尔族COPD显著相关，但关于该位点是如何对COPD的发生、发展产生作用，目前仍尚未清楚，今后仍需进行相关位点的功能研究，培养基因敲除鼠，经熏烟造模成COPD，行NRF2基因rs6706649位点蛋白基因层面研究，以便进一步了解COPD发病机制，为COPD防治提供思路。

综上所述，世居喀什地区维吾尔族人群COPD的发生不仅与年龄、吸烟史、饮酒史、COPD家族史、个人呼吸道疾病史、有害气体或粉尘接触史有关，还与NRF2基因rs6706649位点多态性密切相关，临床应引起足够重视。但本文由于选取病例数偏少，研究结果可能存在偏倚，故今后需作进一步深入研究。