木霉菌对草坪草病原菌的抑菌效果及其机理初步研究

章武，杨锦玉，卢翔，林金梅，牛学礼

（岭南师范学院，广东 湛江524048）

最近几十年，植物病原菌多样性和致病性均呈现不断增加的趋势，其原因不仅与气候变化引起的极端天气有关［1－2］，还与大量除草剂、杀菌剂等农药的长期广泛使用有关，严重地影响着植物的生长、产量以及环境和生态安全。因此，近年来国内外利用拮抗微生物防治植物病害的发生和危害已成为目前研究的重点和热点之一［3－4］。

木霉菌（Trichodermaspp.）是真菌界，半知菌类，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，木霉属真菌［5］。它是自然界中普遍存在，且资源丰富的拮抗微生物［6－7］，通过产生抗生素、细胞壁分解酵素等生物活性物质［8－9］或通过营养竞争、寄生［10］以及诱导植物产生抗性［11－14］等途径对植物病原真菌和细菌产生拮抗作用，从而达到预防和治理植物病害的效果。自Weindling［14］于20世纪30年代首次发现木霉菌对植物病原菌具有拮抗作用以来，木霉菌作为生防因子逐渐被越来越广泛应用于植物病原菌的生物防治，如利用哈茨木霉（Trichoderma harzianum）防治大豆核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）［15］，深绿木霉（Trichoderma atroviride）防治番茄根腐病菌（Phytophthora cinnamomi）［16］等。现已有多种木霉菌生防产品登记注册，在国际上，如美国的T22（哈茨木霉）［17］和以色列的T39（哈茨木霉）［18］等，中国也已研制出T4（哈茨木霉）［19］和T6（长枝木霉）水分散粒剂［20］，L24（绿色木霉）分生孢子［21］和特力克木霉可湿性粉剂［22］等，这些制剂在植物病害防治中均取得较好防效。因此，木霉菌在植物病害的生物防治和环境保护等领域展现了巨大的应用前景。

目前以化学防治方法为主的草坪病害管理和防治措施是限制其健康发展的主要因素之一［26］。草坪草病害的生物防治是当今草坪管理技术的研究热点，以菌治病其优越性在于资源丰富、选择性强、无残留、无污染、成本低、兼防兼治、对保持生态平衡起到长效的作用，但国内外研究木霉菌在草坪草病害防治方面的研究相对较少［27－31］，因此，继续挖掘与探索木霉菌资源对草坪草病害病原菌生防效果及其机理仍是该领域研究的重点。

本研究从海南省高尔夫球场土壤中筛选获得的多株木霉菌菌株中选取生长速度快、产孢量较大的4株菌株，研究其对草坪草病原菌抑制作用及其作用机理，以期为新型、高效的微生物杀菌剂的研制、开发和合理应用提供理论依据和科学资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试4株木霉菌株编号为：SQ-1Q-18（海南，三亚，神泉国际高尔夫球场）、SQ-1Q-15（海南，三亚，神泉国际高尔夫球场）、BD-1F-1（海南，万宁，神州半岛高尔夫球场）、BD-2Q-12（海南，万宁，神州半岛高尔夫球场）。供试的14种草坪草病原菌是笔者收集的常见草坪草病原菌（表1），均为实验室保存菌种。

表1 供试草坪草病原菌信息Table 1 Information of turfgrass pathogens tested in current study

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化 2018年4月，将4℃低温保存于斜面的4株木霉菌和14株草坪草病原菌分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基进行活化，置于25℃恒温培养箱中培养5 d后备用。

1.2.2 对峙培养法测定抑菌活性 用记号笔在PDA培养基平板背面分别标记对峙培养木霉菌和病原菌所处具体位置（木霉菌和病原菌以培养皿中线相对称，间隔3 cm），在无菌条件下，用灭菌打孔器（d=5 mm）对生长良好的4株木霉菌和14种病原菌进行打孔取样，用接种针挑取菌饼并分别接种于已标示好位置的PDA培养基表面进行对峙培养，每个平板上接种一种木霉菌和一种病原菌。对照只在病原菌位置接种病原菌菌饼，每个对峙试验及其对照均设4个重复。置于25℃恒温培养箱中培养，每天观察并记录木霉菌和病原菌的对峙生长情况，并于第3天开始采用“十字交叉法”测量各处理组和对照菌落半径并拍照，每天测定1次，连续测定4 d，根据生长抑制率公式［32］计算生长抑制率。

式中：d0为对照菌落半径（cm），dt为处理菌落半径（cm）。

740 Expression of microRNA-21 in serum exosomes of patients with different severities of asthma and its diagnostic value

1.2.3 拮抗等级测定 根据张瑾等［33］的方法进行拮抗等级测定。木霉菌菌落完全占据整个培养皿，即占据面积为100%，等级为Ⅰ；3/4＜木霉菌菌落占据培养皿面积＜1，等级为Ⅱ；2/3＜木霉菌菌落占据培养皿面积＜3/4，等级为Ⅲ；1/3＜木霉菌菌落占据培养皿面积＜2/3，等级为Ⅳ；0＜木霉菌菌落占据培养皿面积＜1/3，等级为Ⅴ；病原菌菌落占据培养皿面积为100%，等级为Ⅵ。

1.2.4 抑菌作用机理显微观察 在无菌条件下，用移液器吸取1 mL无菌PDA培养基，均匀涂抹于载玻片上，制成一层PDA培养基薄膜。待载玻片上的培养基凝固后，在载玻片两端分别接种SQ-1Q-18木霉菌和14种草坪草病原菌，木霉与病原菌相距3 cm，再将载玻片置于无菌培养皿中，封膜后置于25℃恒温培养箱，每处理3个重复。培养3 d后，当两菌落相互交接时，将载玻片置于光学显微镜下观察木霉菌与14种病原菌相互作用后菌落的形态特征，记录并拍照。

1.2.5 玻璃纸法测定抑菌活性 将玻璃纸剪成直径为9 cm的圆片，经高压蒸汽灭菌后贴于PDA培养基中央（d=9 cm）。将菌株SQ-1Q-18菌饼接种于含有玻璃纸的培养基中央，25℃黑暗条件下培养。待木霉菌落接近玻璃纸边缘时，移除玻璃纸及整个菌落，并在培养皿中央接种各病原菌的菌饼。将病原菌接种于未经处理的PDA培养基作为对照。每个处理及对照设置3次重复。每天观察各病原菌的生长状况，第3天开始测量病原菌的直径并拍照，根据生长抑制率公式计算抑菌效果。

1.2.6 木霉菌菌液粗提液测定抑菌活性 用已灭菌的打孔器（d=5 mm）在活化的PDA平板上取木霉菌饼，用接种针挑取菌饼并接种于含有150 mL马铃薯葡萄糖液体培养基（potato glucose liquid medium，PDB）的500 mL三角瓶中，共接种10瓶，置于28℃、150 r·min－1摇床振荡培养5 d后，用无菌脱脂棉滤去菌丝，再用无菌滤纸过滤。在得到的菌液中加入等体积的乙酸乙酯浸泡24 h后进行萃取，每瓶萃取3次后合并萃取液，并通过旋转蒸发仪在45℃进行浓缩，获得发酵液粗提物。用丙酮溶解粗提物，制备成溶液（10 mg·mL－1），用移液枪在含有PDA培养基的培养皿上均匀涂布10 μL粗提取物溶液，然后在培养皿中心接种病原菌菌饼，用相同体积的丙酮溶液作为对照，置于恒温培养箱中，25℃黑暗条件下培养，每个处理重复3次。每天记录病原菌菌丝生长情况，第3天开始测量病原菌的直径并拍照，根据生长抑制率公式计算抑菌效果。

1.2.7 木霉菌株鉴定 1）形态学鉴定。菌株SQ-1Q-18活化后，在25℃条件下培养7 d，观察菌株生长速度、菌落颜色及表面特征等，在显微镜下观察菌丝、产孢细胞、孢子等菌株的形态特征。2）分子生物学鉴定。将菌株SQ-1Q-18活化后于25℃培养箱培养7 d，用无菌载玻片将菌丝刮下，充分研磨，参照Van Burik等［34］的十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取病原菌基因组DNA并保存于－20℃冰箱。利用White等［35］设计rDNA－ITS区通用引物ITS-1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS-4（5′-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3′），以4株木霉菌真菌基因组为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，20 μmol·L－1引物各1 μL，5 U·μL－1Taq酶0.25 μL，模板DNA 1 μL，加灭菌双蒸水至50 μL。PCR反应条件：94℃预热4 min；94℃30 s，62℃30 s，72℃1 min，共34个循环；72℃延伸5 min。将所有PCR产物分别加入1.0%的琼脂糖凝胶中进行电泳，经溴化乙锭染色后，于凝胶成像仪检测。将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行DNA测序。将测得的ITS序列，提交至NCBI核酸数据库中获得GenBank登录号，同时利用GeneBank数据库中的Blastn软件进行比对和同源性分析。根据比对结果，从Genbank上下载相似度较高的木霉属真菌rDNA－ITS片段，通过https：//mafft.cbrc.jp/alignment在线软件进行序列比对。以亲缘关系相近真菌Nectira berolinensis为外群，使用Mega 7.0软件中的最大似然法（maximum likelihood method）构建系统发育树，并将分析结果结合形态学特征对木霉菌进行鉴定。

1.3 数据分析

用SPSS 22.0的One-Way ANOVA方法，对平板对峙培养下4种木霉菌对14种供试病原真菌的生长抑制率、木霉菌株SQ-1Q-18的次生代谢产物以及粗提取物对14种供试病原菌的抑制率进行方差分析，LSD法比较均值，置信区间设为95%，字母法进行显著性标记。用Adobe Photoshop CC 2019和Adobe Illustrator CC 2018组合照片并注解。用R语言（4.0.0版）pheatmap软件包的pheatmap函数绘制热图，用mat参数添加标准差及显著性字母；用ggplot 2软件包绘制4种木霉菌对供试病原菌总体抑制率的小提琴图和木霉菌株SQ-1Q-18的次生代谢产物及关于粗提取物对14种供试病原菌抑制率的柱形图。

2 结果与分析

2.1 木霉菌对病原菌的拮抗效果

对峙培养第2天，4株木霉菌菌丝开始与病原菌菌丝相互接触。第5天时与对照相比，4株木霉菌株对14种供试病原真菌均有不同程度的拮抗效果，其中木霉菌SQ-1Q-18菌株的拮抗作用最明显。4株木霉菌对地衣状伏革菌（LF）的抑制作用最强，均达100%；其次是对玉蜀黍丝核菌（RZ）有较强抑制作用，其中菌株SQ-1Q-18和BD-1F-1对RZ的抑制率均达100%（图1）。

图1 对峙培养第5天时4种木霉菌与14种草坪草病原菌平板生长状况Fig.1 The growth status of 4 Trichoderma spp.isolates and 14 turfgrasses pathogens on the 5th day of agar confrontation culture

4株木霉菌对14种供试病原菌抑制效果明显，抑制率在40%～100%。与其他3个木霉菌株相比，菌株SQ-1Q-18对立枯丝核菌（RS）、地毯草炭疽菌（CH）、雀稗微座孢（MP）、球黑孢霉（NS）和佩立金平脐蠕孢（BP）的抑制作用较强，抑制率分别为95.5%、88.5%、78.0%、61.6%和59.0%；SQ-1Q-15对草坪草币斑病病原菌（SH）的抑制作用最强，抑制率为79.4%；BD-1F-1对草坪草墨斑病菌（CM）、草茎点霉（PH）、新月弯孢霉（CL）的抑制作用较强，抑制率分别为70.0%，55.4%和44.0%；BD-2Q-12对灰葡萄孢菌（BC）、禾顶囊壳禾谷变种（GG）和木贼镰刀菌（FE）的抑制作用较强，抑制率分别为92.2%，81.9%和69.2%（图2）。

图2 对峙培养第5天时4种木霉菌对14种草坪草病原菌的抑制率Fig.2 The inhibition rate of 4 Trichoderma spp.isolates and 14 turfgrass pathogens on the 5th day of confrontation culture

通过分析4株木霉菌对供试14种病原菌的平均抑菌率，发现木霉菌SQ-1Q-18的平均抑制效果较强，达72.8%，且均值离散度适中，分布密度相对均一（图3），因此选择木霉菌株SQ-1Q-18进一步研究其生防机理。

2.2 对峙培养拮抗作用观察及分析

菌株SQ-1Q-18对供试的14种草坪草病原菌生长均有明显的抑制作用，但SQ-1Q-18对不同的病原菌拮抗等级存在较大差异（表2）。对地衣状伏革菌和玉蜀黍丝核菌的拮抗等级均为I级，即拮抗作用最强。对草坪草墨斑病菌、佩立金平脐蠕孢、立枯丝核菌、地毯草炭疽菌、灰葡萄孢菌、禾顶囊壳禾谷变种、雀稗微座孢的拮抗等级为Ⅱ级。对木贼镰刀菌和草坪草币斑病病原菌的拮抗等级为Ⅲ级。对新月弯孢霉、球黑孢霉、草茎点霉的拮抗等级为Ⅳ级。

表2 木霉菌SQ-1Q-18对14种病原菌生长的拮抗效果及等级Table 2 Inhibition effect of Trichoderma spp.isolates SQ-1Q-18 on the growth of fourteen pathogens

2.3 抑菌作用机理的显微观察

将载玻片上对峙生长的两菌落交界处置于光学显微镜下观察，发现木霉菌对14种病原菌的抑制作用方式相似。主要是在两种真菌相互接触后，木霉菌迅速侵入病原菌生长空间，而后木霉菌菌丝通过缠绕（图4A）在病原菌菌丝体上，与病原菌交错在一起，使病原菌菌丝变细、缢缩（图4B）。严重时甚至导致病原菌菌丝断裂（图4C）；或穿入病原菌菌丝体内（图4D）或寄生在病原菌菌丝表面（图4E），使病原菌菌丝细胞原生质浓缩，直至最后病原菌菌丝细胞降解（图4F）等。

2.4 木霉菌次生代谢产物对病原菌的拮抗效果

将病原菌接种于SQ-1Q-18木霉菌在玻璃纸上生长过的培养基中培养5 d后，除玉蜀黍丝核菌（RZ）和立枯丝核菌（RS）外的12个病原菌生长状况与对照相比均有拮抗效果。这表明SQ-1Q-18木霉菌生长过程中透过玻璃纸产生的次生代谢产物对玉蜀黍丝核菌（RZ）和立枯丝核菌（RS）拮抗作用不明显，对其他12种病原菌均有不同程度的抑制作用（图5A）。

2.5 木霉菌菌液粗提取物对病原菌的拮抗效果

由乙酸乙酯萃取、旋转蒸发仪浓缩蒸干得到的SQ-1Q-18木霉菌粗提取物对14种草坪草病原菌的抑制效果不明显，抑制率均在50%以下（图5B），对各病原菌抑制效果也存在差异，其中，对草坪草币斑病病原菌（SH）和佩立金平脐蠕孢（BP）的抑制率相对较高，分别为43.60%和42.91%；对新月弯孢霉（CL）、草茎点霉（PH）和球黑孢霉（NS）的抑制率较低，均小于5%；而对立枯丝核菌（RS）和玉蜀黍丝核菌（RZ）无抑制效果。

图5 SQ-1Q-18木霉菌对14种草坪草病原菌的抑菌率Fig.5 Antibacterial rate of Trichoderma isolate SQ-1Q-18 against 14 turfgrass pathogens

2.6 木霉菌形态学特征

菌株SQ-1Q-18在PDA上活化后，气生菌丝迅速生长；菌落初期呈白色、毡状，后期孢子簇大量形成，变为浅绿色，致密地平铺在培养基平板上，背面黄绿色或金黄色；分生孢子梗排列呈典型的金字塔形结构，初级分枝间隔分布，成对且大量再分枝；瓶梗细胞单生或2～5个轮生，烧瓶形至安瓿形，大小（7.9～）8.6～12.3（～13.6）μm×（2.2～）2.5～2.9（～3.3）μm（图6A）；分生孢子近球形或椭球形，表面光滑，淡绿色，老熟后呈深绿色，大小（2.5～）3.0～3.3（～3.6）μm×（2.5～）2.8～3.2（～3.5）μm（图6B），根据形态特征初步将木霉菌株SQ-1Q-18鉴定为哈茨木霉。

图6 哈茨木霉（SQ-1Q-18）的形态学特征Fig.6 Morphological characteristics of T.harzianum（SQ-1Q-18）

续表Continued Table

2.7 木霉菌的分子鉴定

菌株SQ-1Q-18测序所得ITS片段长度为595 bp，提交至GenBank获得登录号为MT584872。序列经GenBank网站Blastn比对分析，发现与已发表的多个哈茨木霉序列（MK738145，MN658589，MN602615）相似度均为100%。从构建的系统发育树可知本研究分离的木霉菌SQ-1Q-18与已知哈茨木霉菌株聚在一个分支，自展支持率为100%（图7）。因此结合形态学特征进一步将其鉴定为哈茨木霉。

图7 基于木霉属真菌ITS序列建立的最大似然法系统发育树Fig.7 Phylogenetic tree of Trichoderma spp.resulting from a maximum likelihood analysis of the ITS sequence alignment

3 讨论

大量研究证实木霉菌广泛存在于多种生境中并与其他生物进行各种各样的相互作用，尤其对土传病原真菌有显著抑制作用，因而具有保护植物的能力进而被成功地应用于生物杀菌剂中［36－37］。但不同木霉菌株对同种病原菌的抑制机制和效果也有所不同，本试验用海南省高尔夫球场土壤中筛选获得的4株木霉菌测定其对草坪草病原菌的抑菌作用，并对抑制效果较好的SQ-1Q-18木霉菌抑菌机理进一步研究，发现供试木霉菌对14种草坪草病原菌有不同程度的抑制效果，抑制率为38.3%～100.0%，除地衣状伏革菌外，4株木霉菌对同一病原菌的抑制程度存在一定的差异。本研究发现4株木霉菌对地衣状伏革菌抑制率均高达100%，说明木霉菌对地衣状伏革菌抑制效果极为显著，本研究首次报道了木霉菌具有防治草坪草红丝病的潜力。另外，菌株SQ-1Q-18和BD-1F-1对玉蜀黍丝核菌的抑制率也高达100%，这一结果说明木霉菌对防治草坪草病害的应用有巨大潜力。

已有研究表明木霉菌主要通过寄生、竞争、抗生、溶菌等作用而抑制病原菌，但不同木霉菌的作用机制和抑菌效果有所不同，同时也与病原菌本身生长和免疫特性有关［38－39］。本研究通过对木霉菌SQ-1Q-18菌丝显微结构拮抗特征观察发现木霉菌通过对病原菌菌丝进行缠绕、缢缩的方式使病原菌菌丝变细甚至断裂，或直接穿入或吸附病原菌菌丝的方式寄生，竞争病原菌生长空间，甚至可导致病原菌菌丝细胞溶解，断裂。

通过玻璃纸法研究木霉菌次生代谢产物对病原菌的抑制试验表明，木霉菌SQ-1Q-18在培养基上产生的次生代谢产物对草坪草币斑病病原菌、球黑孢霉和地衣状伏革菌的抑制率达75%以上；由乙酸乙酯萃取、浓缩所得的SQ-1Q-18木霉菌粗提取物对佩立金平脐蠕孢和草坪草币斑病病原菌的抑制率在40%以上。这与El-Katatny等［40］的研究结果相似，其研究发现哈茨木霉的培养滤液可抑制番茄果腐病病原菌孢子萌发，表明木霉次生代谢产物或其粗提物对部分病原菌生长有抑制作用。已有研究表明木霉菌在其生命过程中会产生多种挥发性或非挥发性抗生素［41－44］，本研究中木霉菌分泌了何种抗生性代谢物对病原菌产生抑制作用仍需深入研究。

通过分析对峙培养过程中生长受到明显抑制的地衣状伏革菌、玉蜀黍丝核菌和立枯丝核菌，发现尽管在平板对峙培养中木霉菌株SQ-1Q-18对三者的抑制率均为100%，但通过玻璃纸法产生的次生代谢产物在第3天后对玉蜀黍丝核菌和立枯丝核菌无明显抑制作用，同时通过萃取浓缩获得的粗提取物对玉蜀黍丝核菌和立枯丝核菌亦无抑制作用。但两种方法获得的SQ-1Q-18化合物对地衣状伏革菌的抑制率在14种病原菌中排名靠前（分别为第3、4位）。以上结果表明木霉菌SQ-1Q-18对不同病原菌抑制效果的作用方式不同，对地衣状伏革菌的抑制不仅通过菌丝接触对其进行抑制，而且通过产生不利于地衣状伏革菌生长的化合物抑制地衣状伏革菌菌丝的生长，但对玉蜀黍丝核菌和立枯丝核菌主要通过菌丝缠绕、缢缩、入侵和侵占生长空间等方式进行抑制。这种现象可能与3种病原菌菌株培养性状有紧密联系。地衣状伏革菌菌丝紧贴平板表面生长形成革质菌落，病原菌生长方式使菌丝充分接触培养基表面化合物，因此受木霉次生代谢产物影响较大。而玉蜀黍丝核菌和立枯丝核菌的菌丝生长迅速，菌丝疏松、未紧贴平板表面生长，说明即使菌丝与培养基接触面小也能充分吸收营养，因此菌株受培养基表面化合物影响较小。

利用有生防潜质木霉菌防治草坪草病害已成为目前研究的新思路，如古丽君等［30］研究深绿木霉T2对瓜果腐霉的抑菌作用及机制；姬承东等［45］筛选了木霉菌防治蘑菇圈病原真菌等均取得较好的效果。哈茨木霉作为木霉属真菌中重要生防真菌之一，已被广泛运用于世界各地的植物病原真菌的防治［17－18］，我国利用哈茨木霉菌防控草坪草镰刀菌枯萎病和褐斑病已取得相关知识产权［46－47］。本研究首次证实哈茨木霉SQ-1Q-18对地衣状伏革菌和玉蜀黍丝核菌的防治效果最为理想，其次生代谢产物或菌液粗提液对不同病原菌抑制效果不同，此外木霉菌作为草坪草病害的生防因子的机理需进一步研究。本研究结果可以为草坪草病害生物防治提供参考，并且为微生物杀菌剂的研发提供依据。

4 结论

1）采用对峙培养的方法观测4株木霉菌株对14种草坪草病原菌的拮抗作用，结果表明各木霉菌对不同病原菌表现出不同程度的拮抗作用。其中菌株SQ-1Q-18抑菌效果最佳，其对玉蜀黍丝核菌和地衣状伏革菌的抑制率高达100%，对灰葡萄孢菌、地毯草炭疽菌和立枯丝核菌的抑制率大于80%，且对供试病原菌的平均抑制率高达72.8%。

2）通过显微镜观察得知木霉菌菌株SQ-1Q-18可通过产生抑菌圈侵占病原菌的生长空间，覆盖和深入病原菌内部与其相互缠绕使得病原菌菌丝变细、缢缩甚至断裂，或直接穿入病原菌菌丝内部吸取营养致使菌丝细胞溶解。

3）木霉菌菌株SQ-1Q-18能产生对草坪草病原菌有抑制活性的拮抗化合物，其中玻璃纸法产生的拮抗物质对草坪草币斑病病原菌、球黑孢霉及地衣状伏革菌拮抗作用较强，接种3 d后，其相对抑制率分别高达91.77%、89.80%和79.59%；木霉菌粗提取液对草坪草币斑病病原菌和佩立金平脐蠕孢的抑制率相对较高，分别为43.60%和42.91%。

4）通过形态学特征和ITS rDNA序列将木霉菌株SQ-1Q-18鉴定为哈茨木霉。