金丝桃苷对胶原诱导性关节炎小鼠的治疗作用

金向楠 高薇 冯欣 隋海娟 付强

锦州医科大学附属第一医院1风湿免疫科，3骨科（辽宁锦州121000）；2锦州医科大学基础医学药理学教研室（辽宁锦州121000）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以累及外周小关节为主要表现的难治性自身免疫性炎性疾病［1-2］。其病理学特征体现为滑膜组织过度增生，大量炎细胞浸润，关节软骨和骨的进行性破坏［3-4］。尽管近年对RA 机制的进一步认识推动对该病治疗的进展，新药和新疗法层出不穷，也极大地改善了患者的预后，但是目前临床上仍存在诸多难题，缺乏安全有效的治疗方法［5-6］。因此进一步探讨及寻找有效的干预药物具有十分重要的科学意义。

金丝桃苷（hyperoside，Hyp）又名槲皮素-3-Oβ-D-吡喃半乳糖苷，属黄酮醇苷类化合物，广泛存在于各种植物体内，如金丝桃科、蔷薇科、桔梗科、葵科、藤黄科、豆科等的果实与全草中，具有镇痛、抗炎、抗氧化，改善心血管循环功能等药物作用［7］。Hyp 通过抑制肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α），白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）和一氧化氮（NO）等炎症因子的产生，有显著的抗炎作用，在体外可以显著抑制多种肿瘤细胞的增殖。

笔者前期的研究已证实［8-9］，金丝桃苷可以抑制人的类风湿关节炎患者的成纤维样滑膜细胞的过度增殖，并通过抑制核转录因子-κB（NFκB）的信号转导通路调控多种基因表达产生抗炎作用。本实验通过胶原诱导性关节炎小鼠（collagen induced arthritis，CIA）模型针对Hyp 是否会对RA有抗炎和抑制软骨受侵蚀作用进行研究，为该药在临床上治疗RA 提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物8 周龄雄性DBA/1 小鼠45 只，体质量20 ～24 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，SPF 级饲养。

1.1.2 主要药品、试剂与仪器金丝桃苷（Hyperoside），黄色粉末，纯度＞98%，购于南京春秋生物工程有限公司；IL-6 购于Sigma 公司；弗氏完全佐剂及牛Ⅱ型胶原蛋白购于Sigma 公司，HE 染色试剂盒购于碧云天生物技术研究所，其他相关试剂均由锦州医科大学药理实验室提供。倒置相差显微镜，日本Olympus 公司。Luminex200 型多功能流式液相芯片分析仪，美国Millipore 公司。切片机，日本Yamato 公司。电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CIA 小鼠模型的建立，分组和用药方法小鼠随机分为正常对照组（8只），胶原诱导组（35只）。将牛Ⅱ型胶原溶于0.01 mol/L 的冰醋酸溶液中，使其终浓度为2 mg/mL，4 ℃过夜。取上述溶液与弗式完全佐剂等体积混合乳化，得到终浓度为1 mg/mL的牛Ⅱ型胶原乳化液。初次免疫在胶原诱导组小鼠尾根部注射150 μL 混合乳液，将初次免疫定为第0 天，增强免疫于第21 天再次注射150 μL 同样新鲜制备的混合乳液，正常对照组均给予等量生理盐水注射［10］。初次免疫4 周后开始，动态观察小鼠的足掌厚度测量及临床关节炎指数变化，检查小鼠关节炎发病及严重程度，每周观察2 ～3 次并进行临床关节炎评分，第31 天在胶原诱导组中挑选出评分为2 分的小鼠随机分为三组（每组8 只），进一步分为诱导组和药物治疗组（25 mg/kg和50 mg/kg）。金丝桃苷采用腹腔内注射，每天一次直至处死。第52 天处死，取小鼠后踝关节，常规固定、脱钙、石蜡包埋及切片处理，用于HE 染色。见图1。

图1 CIA 小鼠模型的诱导和给药处理方法Fig.1 Induction and treatment of CIA model mice

1.2.2 足掌厚度测量及关节炎指数评分初次免疫4 周后，以电子游标卡尺测量小鼠足掌厚度，每周2 ～3 次，检查小鼠关节炎发病及严重程度，每周观察2 ～3 次并进行临床关节炎评分。关节炎炎症指数评分标准：0 分，关节正常、无红肿；1 分，小趾关节轻微红肿；2 分，趾关节和足跖肿胀；3 分，踝关节以下的足爪肿胀；4 分，包括踝关节在内的全部足爪肿胀，伴有关节僵硬或强直；每只小鼠的关节炎症的总评分为四肢评分的总和，每只小鼠的最高分值为16 分，关节总评分大于1 的小鼠为建模成功小鼠［11］。

1.2.3 血清细胞因子测定动态观察并给药至第52 天后，处死，取血清，采用ELISA 法测定小鼠血清中TNF-α及IL-6 的含量。按照ELISA试剂盒说明书进行操作，每孔分别加入标准品或样品100 μL，放置于36 ℃水浴箱孵育90 min，充分洗涤5 次，再加入一抗100 μL/孔，再次36 ℃孵育60 min。洗板5次，加酶标抗体100 μL/孔，避光36 ℃孵育30 min，再次洗板5 次后，加入底物100 μL/孔，避光36 ℃孵育15 min，加入终止液，用酶标仪在450 nm 波长条件下测定各孔OD 值。

1.2.4 组织病理学评估动态观察并给药至第52天后，处死，取小鼠后踝关节，常规固定、脱钙、石蜡包埋及切片处理。HE 染色：将准备好的切片，常规经过二甲苯及梯度浓度酒精脱蜡至水。入苏木素染色10 min，蒸馏水冲洗，酸性乙醇分化3 s，蒸馏水洗1 min。入伊红染色5 min，蒸馏水冲洗。脱水、透明、封片，显微镜下观察组织病理学改变并拍照。

1.3 统计学方法以上实验均重复至少3 次，数据采用SPSS 17.0 软件处理分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较应用单因素方差分析，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hyp 对CIA 模型小鼠足肿胀度的影响模型组小鼠于免疫后第28 天开始出现后爪部及踝关节轻微肿胀，逐渐皮肤发红，至第46 天左右CIA 模型组小鼠关节红肿达到最高峰，部分小鼠皮肤出现结节、红斑甚至溃烂，第52 天发现有的小鼠关节伴有僵直。同时模型组小鼠伴有饮食及活动减少，体质量增长减慢，毛色泛黄无光泽。与模型组相比，用药组早期也出现关节轻微肿胀，第31 天给药后小鼠关节炎症进展明显减慢，肿胀程度明显减低。而正常对照组未出现小鼠关节红肿，直至第52 天处死未出现任何症状及体征改变。见图2A。在CIA 模型进展过程中，模型对照组小鼠的足掌厚度逐渐增加，与模型对照组相比，金丝桃苷25 mg/kg 治疗组和金丝桃苷50 mg/kg 治疗组小鼠的足掌厚度均降低，且用药剂量50 mg/kg 治疗组更为明显，与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。见图2B。

图2 金丝桃苷对CIA模型小鼠足肿胀度的影响Fig.2 Effect of Hyperoside on Paw swelling in CIA model mice

2.2 Hyp对CIA模型小鼠关节炎指数的影响CIA模型组小鼠免疫后第28 天开始发病，首先出现小趾关节轻微肿胀，然后蔓延至足跖及踝关节明显红肿，最后累积至踝关节在内的全部足爪肿胀，有的小鼠伴有关节僵硬或强直。CIA 模型组小鼠于第46 天临床关节炎指数评分达到最高，随后逐渐下降，不同浓度的金丝桃苷治疗组的评分从第31天开始与CIA 模型组相比显著下降，高剂量金丝桃苷治疗组评分较低剂量治疗组下降更为显著，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图3。

图3 金丝桃苷对CIA 模型小鼠关节炎指数的影响Fig.3 Effect of Hyperoside on joint inflammatory index in CIA model mice

2.3 Hyp 对CIA 模型小鼠血清TNF-α及IL-6 含量的影响用ELISA 法测定小鼠血清中TNF-α及IL-6 的含量，来评定是否金丝桃苷可以抑制CIA模型小鼠炎症因子的产生。ELISA 结果显示，CIA模型组小鼠血清中TNF-α及IL-6 的含量明显增加，与正常对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01），而用药组剂量为25、50 mg/kg 的Hyp 使得小鼠血清中TNF-α及IL-6 的含量成剂量依赖性降低。统计学分析数据：模型组与用药组25 mg/kg 相比（P＜0.05），模型组与用药组50 mg/kg 相比均差异有统计学意义（P＜0.01）。见图4。

图4 金丝桃苷对CIA 模型小鼠血清TNF-α及IL-6 含量的影响Fig.4 Effect of Hyperoside on serum concentration of interleukin-6（IL-6）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）in CIA model mice

2.4 Hyp 对CIA 模型小鼠踝关节组织病理学变化的影响进行HE 染色观察小鼠踝关节滑膜增生及炎症浸润情况，与正常对照组相比，CIA 模型组滑膜组织增生明显，且伴有大量炎症细胞浸润。与模型组相比，金丝桃苷高剂量组滑膜组织形态较好，仅有少量炎症细胞浸润，与正常对照组形态基本接近。病理学染色表明金丝桃苷对CIA 小鼠关节的病理组织结构有明显的改善作用，可明显减轻上述病理变化。见图5。

图5 金丝桃苷对CIA 模型小鼠踝关节组织病理学变化的影响（HE 染色，×200）Fig.5 Effect of Hyperoside on histopathological changes of ankle joints in CIA model mice（HE stained，×200）

3 讨论

RA 的发病机制在整个病理生理过程中集中体现在自身免疫性炎症，滑膜组织增生及关节软骨和骨的进行性破坏，并且它们之间相互作用，形成了复杂的网络［4，12-13］。胶原诱导性关节炎小鼠模型是目前研究类风湿的动物模型［14］，CIA 的特征是多关节炎，发病机制和病理特征与人类风湿关节炎类似，CIA 的建立极大的推进了RA 发病机制及治疗等方面的研究［10］。本实验研究利用牛Ⅱ型胶原与弗氏佐剂诱导了CIA 小鼠模型，小鼠在免疫后第28 天开始出现关节肿胀，至第46 天关节肿胀最为严重，有的小鼠伴有皮肤结节，红斑甚至溃烂，最终出现关节僵直［15］。在第28 ～52 天对CIA 小鼠的足掌厚度及临床关节炎指数评估的研究结果表明，金丝桃苷能显著减轻CIA 小鼠模型关节炎的症状，表现为其治疗组小鼠关节炎指数评分明显低于模型组，组织学结果表明治疗组小鼠关节滑膜增生和炎症细胞浸润减轻。由此提示，金丝桃苷对于CIA 小鼠模型具有一定的治疗作用。

在RA 患者的血清或关节液中，可检测到高水平的促炎性细胞因子的表达，如TNF-α、IL-6、IL-1、IL-1β及细胞黏附分子（如ICAM 1）等，同样的CIA 小鼠模型在发生发展中也会出现炎症因子的大量释放［16-18］。这些促炎症细胞因子的产生增多，可以进一步刺激滑膜细胞的增殖，过度增殖的滑膜细胞又可以继续上调细胞因子的水平，并诱导和提高蛋白酶表达水平的增多，进而促进了软骨和骨的破坏［19-21］。本实验通过ELISA 检测细胞因子，测得金丝桃苷可以呈剂量依赖性的抑制TNF-α及IL-6 的产生［22］。还进一步通过组织病理学染色，同样证实了金丝桃苷对滑膜细胞过度增生，关节周围滑膜组织炎症细胞浸润有明显的改善作用。由此证明，金丝桃苷具有抗炎作用，但目前的作用机制尚不明确，仍有待进一步研究。综上提示，金丝桃苷对CIA 小鼠具有治疗作用，并且其对关节炎的治疗作用可能与抗炎作用有关。

本研究对小鼠足爪肿胀程度的观察、足掌厚度及临床关节炎指数的评分，发现金丝桃苷对于CIA 小鼠模型有显著的治疗作用。金丝桃苷是通过降低细胞因子的产生，起到有效抑制CIA 小鼠模型滑膜增生，炎症反应的作用。这些结果从整体水平上证实了金丝桃苷对RA 的治疗作用，不仅丰富了治疗RA 的临床研究，也为中药治疗RA 提供新的研究方法和思路。目前RA 的治疗的最重要的目标是预防骨质破坏，以维持正常的关节功能，尽管临床上对于治疗它有了很大的进步，也极大地改善了病人的预后，但仍缺乏安全有效的治疗方法。金丝桃苷有望成为一种副作用小的中药，对RA 起到抗炎，抗风湿的治疗作用。