7株根际促生菌对设施小黄瓜生长发育及土壤根际环境的影响

申佳丽，曹树槟，焦甜甜，朱红艳，曹云娥

(宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021)

近年来，化肥的大量投入使我国作物单位面积产量大幅增加，我国年蔬菜产量达到70 346.72万t(截止2018年底)[1-2].然而，我国每年的化肥用量占全球总量的1/3，而耕地面积仅占全球耕地面积的8%左右，单位耕地面积化肥施用量明显高于国际平均水平[3].同时我国的化肥有效利用率较低，每年农用化肥的60%～70%进入土壤环境[4].由于人们生活水平的提高，对蔬菜需求日益增大，进而设施蔬菜种植面积扩大，但是由于设施环境农事操作密集、化肥的过量使用、土壤连作而导致土壤质量下降、土传病害频发和农田环境污染，从而使作物收益率降低甚至耕地退化，所以单靠化肥来提高蔬菜产量已不能满足我国农业“绿色”发展的要求，因此，植物根际促生细菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)已成为国内外研究热点之一[5].植物根际促生菌主要通过活化植物根际养分和促进根系发育提高养分利用率、促进植物生长[6-7].PGPR对植物的作用主要分为3种不同类型：第一种能够固氮、溶磷、解钾、溶铁、分泌植物激素(IAA)、相关调控物质和挥发性物质的释放等；第二种是对侵染和危害植物的流行性病原菌和病虫有拮抗作用或者是自身分泌抗生素物质的微生物；第三种是自身能够降解农药残留和降低连作产生自毒物质，保护根系生长[8-9].

植物长期连作后，根际土壤环境变化导致土壤微生物发生变化，一些繁殖能力强的寄生害虫和有害微生物种群在根际土壤中处于优势地位，随着连作时间的增长，土壤中的病原菌数量在原有基础上积累，增加了土传病害的发生几率.

不同植物根际促生菌的促生机理存在多样性，即使是同一种促生菌在不同植物上也会产生不同的作用效果.目前植物根际促生菌多用于设施黄瓜和西瓜栽培.如李英楠等[10]采用菌液灌根方法研究多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)G15-7、NSY50和绿针假单孢菌(Pseudomonaschlomraphis)HG28-5在设施黄瓜栽培上的应用效果，结果表明3种菌株均能够促进黄瓜植株生长、提高叶绿素含量和根系活力、改善果实营养品质；丁方丽等[11]通过灌根的方法将普城沙雷菌悬液灌注到黄瓜根际土壤，结果表明，根部灌注普城沙雷菌能显著促进苗期和田间生育期黄瓜生长发育，并显著提高根系活力、产量和品质，黄瓜产量比对照增加 32.22%.徐伟慧等[12]研究了不同西瓜PGPR分泌激素能力和菌株间的拮抗作用，构建复合菌剂并研究其对西瓜根系生长的影响，结果表明复合菌剂R2对西瓜根系具有明显的促生效应，复合菌剂R2的4株菌分泌赤霉素的能力远远超过R1和R3，这可能是R2促生的机制之一.小黄瓜(CucumissativusL.)又名“水果黄瓜”“无刺小黄瓜”，葫芦科甜瓜属，表面无刺有光泽，黄瓜肉质脆嫩，甜甘多汁，是果菜两用佳品，是近几年新兴的栽培新品种.

PGPR是一种方兴未艾的生物防治技术，在克服连作障碍、提高作物品质、产量等方面具有重要作用，而此类研究较少.针对不同的寄主和环境选择最适宜的促生菌，更好地促进植物生长和生防效果，也符合农业可持续发展的要求.目前已鉴定出多种 PGPR 菌株，其中的芽孢杆菌因抗逆能力强而备受关注.芽孢杆菌可分泌产生多种活性代谢物，如多黏菌素、抗菌肽、抗病毒活性物质等，丰富的生理特征使其在农业、发酵工业、医药行业及食品领域等具有广泛的应用价值[17].

基于此，本研究从多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)、巨大芽孢杆菌(Baeillusmegatherium)、苏云金芽孢杆菌(Badcillusthuringiensis)7种根际促生菌中筛选出最适合小黄瓜生长的PGPR菌株，研究根际促生菌对设施小黄瓜在缓苗后的营养生长时期、结瓜初期与膨瓜期的养分吸收利用及小黄瓜品质和产量的影响，为今后设施小黄瓜生物菌肥的推广应用提供菌种资源.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 多粘芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌均由沧州生物科技有限公司提供的商品菌株，菌剂体积分数均为2亿/mL活菌数.

1.1.2 供试作物 供试作物为碧玉3号小黄瓜.

1.1.3 供试土壤 试验地点在宁夏回族自治区银川市宁夏贺兰产业园区日光温室中进行.试验基地地处宁夏平原北部，气候干燥，光照充足，年日照时数2 800～3 200 h，无霜期短，年降水量较低，而年蒸发量较高，属于典型的温带大陆性气候.土壤的基本理化性质：EC1.2 ms/cm，pH 7.53，全氮90 mg/kg，速氮14 mg/kg，速钾603 mg/kg，全磷440 mg/kg，速磷 223.99 mg/kg，有机质2.26 g/kg.

1.2 试验设计

1.2.1 制备菌剂 本试验为完全随机试验设计，由西向东共设置8个小区，编号为B0、B1～B7，每个小区内定植4垄，每垄定植2行，每行23株，株距为40 cm，行距为20 cm，行间距为50 cm，小区总面积为20.16 m2，B0为不加菌剂的对照，B1～B7分别为菌剂处理，分别施加多粘芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌.

将培养基(5 g蛋白胨，1 g酵母浸粉，2 g CaCO3，5 g NaCl，0.32 g MgSO4.7H2O，1 g K2PO4，1 g NaOH)与蒸馏水按1∶1 200比例配成液体培养基放置备用.取1 g菌剂粉末加入300 mL液体培养基中180 r/min 28 ℃振荡培养3 d，再将其加入1 200 mL培养基中，制成体积分数为2亿/mL的菌液1 500 mL.

1.2.2 施入菌剂 灌根时，将培养好的菌液立即运至日光温室，拨开小黄瓜幼苗根部覆土，使其露出主根，向每株幼苗根部施入40 mL菌液，而后立即用土壤覆盖，避免根部长时间暴露在空气中.菌液分别在定植缓苗后、结瓜初期、膨瓜期共施用3次.每个小区植株均处理.其余追肥及灌水处理均相同.

1.3 样品采集与分析

1.3.1 土壤样品的采集 土壤样品在小黄瓜缓苗后、结瓜初期、膨瓜期3个时期，各菌液灌根后一周，用土钻采集植物根围土壤(距离植株茎2 cm左右)，于每个小区中间行选取5个采样点，采集后将样品混合为1个重复的总样.将土壤样品过2 mm筛并混匀，测定其理化性质.

1.3.2 生长指标的测定 将长出两片真叶的黄瓜幼苗移植至田间，待定植缓苗后30 d后测量小黄瓜植株株高、茎粗、叶面积、节数，采用95%乙醇分光光度计法测定小黄瓜叶绿素a、叶绿素b、叶黄素.

1.3.3 土壤指标的测定 参考鲍士旦[18]的方法测定土壤理化性质，分别用pH计与EC计(土壤/水为1∶5)测定土壤pH与EC；用凯式定氮法测定土壤速氮;采用高氯酸-硫酸消化，钼锑抗比色法测定土壤全磷；采用碳酸氢钠浸提，钼锑抗比色法测定速磷；采用乙酸铵浸提，火焰分光光度计测定土壤速钾；采用重铬酸钾——硫酸氧化法测定土壤有机质；采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定土壤脲酶活性；采用磷酸苯二比色法测定土壤磷酸酶活性；采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定土壤蔗糖酶活性与纤维素酶；采用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢活性.

1.3.4 小黄瓜品质的测定 在小黄瓜成熟期，采用蒽酮法测定可溶性糖含量，采用2,6-二氯酚靛酚滴定比色法[19]测定维生素C含量，采用NaOH滴定法测定可滴定酸含量，采用浓硫酸-水杨酸比色法测定硝酸盐含量[20]，采用折光仪测定可溶性固形物含量.

1.3.5 小黄瓜产量的测定 每个小区中间行随机选取10棵植株测量整个收获期的果实产量.

1.4 小黄瓜综合评价指数 CQI的计算

1.4.1 指标的线性转换 鉴于各个指标的单位不同，首先对所有生长指标及土壤指标进行无量纲转换，转换后各指标的数值均介于0～1.采用无量纲转换线性得分法[21].基于对黄瓜生长发育的影响，将所有指标分为“有利”与“有避”两大类：“有利”指标主要包括有机质、速氮、速钾、速磷、全氮、全磷、土壤酶、株高、茎粗、叶面积、叶绿素a、叶绿素b、可溶性固形物、可溶性糖、有机酸、VC、糖酸比、产量等，其数值表现为“越高越好”；“有害”指标主要包括硝酸盐、类胡萝卜素等，其数值表现为“越低越好”.“有益”指标计算：T=(Y-Ymin)/Ymax-Ymin)，“有害”指标为：1-T.其中，T为指标得分值；Y为实际测量值；Ymax和Ymin分别表示每个指标所测得的最大值和最小值.

1.4.2 小黄瓜综合评价指数CQI的计算 采用直接加和法，通过公式∑ni=nTi计算获得小黄瓜综合评价指数CQI(Cucumber Quality Index).

1.5 数据分析

数据整理及分析釆用Excel 2012和SPSS 21.0进行，采用Origin 2018进行作图.利用LSD方法进行单因素显著性分析，利用CQI进行综合评定.

2 结果与分析

2.1 7株根际促生菌对设施黄瓜生长发育的影响

2.1.1 7株根际促生菌对设施黄瓜长势的影响 植物形态指标是植物最直观的指标.由表2可知，与对照相比，各处理对小黄瓜植株的株高、茎粗、叶面积无显著性影响，而B4处理的小黄瓜节数显著高于对照组9.4%.可能因为前期植株长势较旺盛，小黄瓜长势受土壤养分影响较大，受土壤微生物影响较小.

表1 不同处理对小黄瓜植株长势的影响

2.1.2 7株根际促生菌对设施小黄瓜叶绿素及类胡萝卜的影响 叶绿素是植物光合作用的主要色素，在光合作用的光吸收中起主要作用.由表2可知，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量各处理差异明显，其中B4与B7处理最高.B4、B7处理的叶绿素总量显著高于对照14.56%；B4、B7处理的叶绿素a、叶绿素b显著高于对照组11.3%、10.98%；综上所述，B4和B7处理对小黄瓜的光合作用具有显著性影响.

2.1.3 7株根际促生菌对设施小黄瓜品质的影响 由表3可知，B6处理的VC含量显著高于对照9.13%；B1处理的有机酸含量显著低于有机酸23.07%；B1处理的可溶性固形物显著高于对照14.65%；B4处理的可溶性糖显著高于对照组41.60%；B1处理的硝酸盐显著低于对照31.33%；B5处理的糖酸比显著高于对照29.17%.

2.1.4 7株根际促生菌对设施小黄瓜植株养分含量的影响 N、P、K是植物生长所必须的元素.由表4可知，植株根中，B5处理的钾含量显著高于对照22.01%，B5处理氮含量最高为3.88%；B5处理磷含量最高为0.38%，显著高于对照54.79%；而除B5处理外，其余各处理氮含量显著高于对照，其中B6处理最高为0.22%.植株茎中，B2处理的钾含量显著高于对照16.64%；B4处理的氮含量显著高于对照66.67%；B2处理的磷含量显著高于对照组23.40%；植株叶中钾含量B5显著高于对照14.53%，B4处理的磷含量显著高于对照21.88%，B1处理氮含量显高于对照30%.综上所述：B5处理即胶质芽孢杆菌对小黄瓜根中钾、磷，茎中钾、氮，小黄瓜叶中磷、钾有显著性影响.

表2 不同处理对小黄瓜叶片叶绿素及类胡萝卜素的影响

表3 不同处理对小黄瓜品质特性的影响

表4 不同处理对小黄瓜植株养分的影响

2.1.5 7株根际促生菌对设施小黄瓜产量的影响 产量代表了作物生产力的强弱，同时是农民经济收入的来源.由图1可知，各根际促生菌处理667m2产量均高于对照组，其中B4(胶质芽孢杆菌)667 m2产显著高于对照15.89%，综上所述，根际促生菌可增加蔬菜产量，这与许春梅等[22]的试验结果一致.

图1 不同处理对小黄瓜产量的影响Figure 1 Effects of different treatments on the yield of Cucumis sativus L.

2.2 7株根际促生菌对土壤根际环境的影响

2.2.1 7株根际促生菌对各时期土壤pH与EC的影响 由图2-A可知，小黄瓜缓苗后、结瓜初期，各菌剂处理EC值显著低于对照组；膨瓜期，B3处理的EC值显著高于对照组57.19%，其中B3处理EC值为1.75 ms/cm.

由图2-B可知，缓苗后B1、B6处理的pH显著高于对照；结瓜初期，B2处理的pH显著高于对照；膨瓜期，B2处理的pH显著高于对照组23.51%.

图2 不同处理对土壤EC、pH的影响Figure 2 Effect of different treatments on EC,pH

2.2.2 不同处理对土壤有机质的影响 由图3可知，小黄瓜缓苗后，B2处理后小黄瓜根际土壤的有机质显著高于对照组12.86%，其中B2、B3处理最高为35.82、35.74 g/kg；结瓜初期，B4、B5、B6处理后小黄瓜根际土壤的有机质含量显著高于对照组37.65%、37.65%、5.88%，其中B5处理最高为29.58 g/kg；膨瓜期，B3、B4、B5、B6处理后小黄瓜根际土壤的有机质显著高于对照组5.80%、12.50%、13.42%、21.05%，其中B6处理最高达到22.76 g/kg，比较前两个时期，膨瓜期的土壤有机质含量较低，可能原因是植株在此时期代谢旺盛，吸收土壤中的营养，促使果实生长发育.

2.2.3 不同处理对土壤速效养分的影响 土壤速效养分为植物直接可吸收养分，速效养分的高低体现了植物利用土壤中养分的多少.由图4-A可知，缓苗后小黄瓜根际土壤速氮含量对照最高，可能原因是植株在生长旺期，所需氮含量较大，将土壤里的氮元素吸收以供植株生长发育.结瓜初期，各处理的速氮含量均显著高于对照；膨瓜期，B6处理速氮含量显著高于对照组59.72%，其中B6处理最高为18.48 mg/kg.由图4-B可知，缓苗后，小黄瓜根际土壤速磷含量除B1、B4外，其余处理显著高于对照组，其中B5处理最高为266.83 mg/kg；结瓜初期，B5处理为291.37 mg/kg显著高于其余处理，膨瓜期，除B2处理之外，其余处理显著高于对照组.由图4-C可知，缓苗后B5处理的土壤速钾含量显著高于其余处理，结瓜初期，B6处理后小黄瓜根际土壤的速钾含量显著高于对照组47.33%，膨瓜期，B6处理后小黄瓜根际土壤速效钾显著高于对照73.33%.综上所述，B5处理在缓苗后对小黄瓜根际土壤速钾、速磷具有显著影响；B6处理在膨瓜期对小黄瓜根际土壤速钾、速氮具有显著性影响.

图3 不同处理对土壤有机质的影响Figure 3 Effect of different treatments on soil organic matter

图4 不同处理对土壤速效养分的影响Figure 4 Effect of different treatments on available soil nutrients

2.2.4 不同处理对土壤全效养分的影响 土壤全效养分是植物所吸收的速效养分的后续力量.由图5-A可知，缓苗期B3处理土壤全氮为0.14 g/kg，显著高于对照45.83%；结瓜初期，B7处理的土壤全氮含量为0.14 g/kg，显著高于31.88%，膨瓜期；B6处理土壤全氮含量是0.18 mg/kg，显著高于对照53.95%.

由图5-B可知，结瓜初期B2处理的土壤全磷含量为0.63 g/kg，显著高于对照50.72%；膨瓜期B5处理的土壤全磷含量不0.55 g/kg，显著高于对照10.66%.

2.2.5 不同处理对土壤酶系的影响 脲酶是一种作用于线型酰胺的C-N键的水解酶，其酶促产生的氨是植物的氮源之一.由图6-A可知，小黄瓜定植缓苗后，B5处理后脲酶活性显著高于对照组17.75%；而结瓜初期，B7处理后的脲酶活性显著高于对照组71.91%，膨瓜期，B4处理后的脲酶活性显著高于对照组34.25%.

在生物体中和土壤中存在过氧化氢酶，过氧化酶能促进过氧化氢分解为水和氧气，从而降低过氧化氢对植物的毒害作用.由图6-B可知，各菌剂浇灌小黄瓜根际土壤，不同时期的过氧化氢酶无显著性变化.

图5 不同处理对土壤全效养分的影响Figure 5 Effect of different treatments on soil total nutrients

土壤蔗糖酶对增加土壤中易溶性营养物质起着重要作用.研究证明，蔗糖酶与土壤许多因子有关，如有机质、磷含量、微生物数量剂土壤呼吸有关.由图6-C可知，小黄瓜定植缓苗后，除B2处理外，其余处理蔗糖酶活性显著高于对照组20.88%，其中B7处理蔗糖酶活性最高；结瓜初期，B2的蔗糖酶活性显著高于对照组50%；膨瓜期，B5处理蔗糖酶活性显著高于对照组29.37%.

土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷化合物矿化成无机磷的酶，其活性高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性.由表6-D可知，小黄瓜定植缓苗后，B5处理磷酸酶活性显著高于对照组58.51%；结瓜初期，B5的磷酸酶活性显著高于对照组147.88%，膨瓜期，B6处理蔗糖酶活性显著高于对照组61.52%.

图6 不同处理对土壤酶的影响Figure 6 Effects of different treatments on soil enzymes

2.3 7株根际促生菌对小黄瓜生长发育指标与土壤特征参数CQI评价

为了综合评价7株根际促生菌对小黄瓜的影响，构建了小黄瓜综合评价指数CQI，不同处理的综合评价指数 CQI排序为：B4>B1>B5>B6>B7>B2>B3>B0，芽孢杆菌对小黄瓜的生长有积极作用，其中枯草芽孢杆菌对小黄瓜综合影响最大，其次是多粘芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌(表5).

表5 不同处理对小黄瓜综合评价指数的影响

3 讨论

根际促生菌(PGPR)的概念最早是由Kloepper等[23]提出的，是能够促进宿主植物生长的不可或缺的根际微生物.芽孢杆菌是土壤微生态的优势种群之一，能形成具有较强抗逆能力的芽孢，有益于其在生物有机肥的生产利用及土壤微生态环境中的生存与定殖[24]，在土壤中接种一些 PGPR 能够促进土壤中闭蓄态 P 的溶解释放，增加土壤中矿质态 N、有效P、K 的含量，提高养分利用率，有利于植物体对N、P、K 的吸收利用[25].

3.1 7种根际促生菌对各个时期小黄瓜生长发育的影响

根际促生菌通过寄主在土壤或根表皮，从而减少土壤中有害微生物的积累，或者降低连作产生自毒物质，保护根系生长，最后增加产量，芽孢杆菌具有能够产生内生芽孢、抗逆性强、繁殖时间短、营养要求简单、易定殖等优点，被国内外研究人员当作主要生防菌进行应用[25].目前研究认为，芽孢杆菌主要通过抑制土壤中病原菌或与特定的病原菌竞争营养和空间等途径来减少病原菌的数量和根系的感染，减少根际病害发生，间接对解除连作障碍发挥作用.如Nosheen 等[26]研究发现根际促生菌 Azospirillum brasilense 和 Azotobacter vinelandii 与化学肥料混合施用，能够促进根系的生长，显著增加叶面积指数，提高叶绿素含量，替代当前化肥施用量的50%，而不影响当季植物的生长；Habibi 等[27]研究发现从玉米根际土壤中分离出的短小芽孢杆菌能够显著地促进水稻的生长.朱红艳等[28]的研究结果表明，根际促生菌对西瓜茎粗，叶面积有显著的促生作用，而本研究中根际促生菌对伸蔓期的小黄瓜的株高、茎粗、叶面积均无显著性影响.朱红艳的研究结果与本研究结果略有不同，有可能是在试验过程中小黄瓜生长至打顶时，抑制了小黄瓜的生长.李一伦等[29]研究发现，巨大芽孢杆菌菌剂对烟草叶绿素的促生作用最显著.而本研究结果是枯草牙孢杆菌与苏云金牙孢杆菌对小黄瓜叶绿素含量有显著的促生作用.刘泽平等[30]的研究表明，黑龙江水稻根际土壤中根际促生菌主要为芽孢杆菌属菌株，这类菌株可以显著提升土壤中有效钾、有效磷的积累，促进水稻生长.

3.2 7种根际促生菌对各时期土壤酶的影响

土壤作为小黄瓜生长的载体，其土壤性质与作物产量有密切联系，而土壤酶是土壤性质的重要组成部分，在土壤物质循环与能量转化过程中起着重要催化作用.赵海霞等[30]研究表明不同浓度芽孢杆菌悬浊液对土壤脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶、磷酸酶的酶活性的影响不同.任旭琴等[31]的研究表明每667 m2施用 200～400 g芽孢杆菌菌剂能够显著改善根际土壤微生态，提高土壤脲酶、蔗糖酶、蛋白酶、过氧化物酶和脱氢酶活性，降低过氧化氢酶活性；芽孢杆菌菌剂能够显著缓解淮安红椒的连作障碍.本研究结果得出，B4(枯草芽孢杆菌)悬浊液对土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶的活力有显著提升，故浇灌胶质芽孢杆菌有利于改善小黄瓜根际土壤环境.

4 结论

设施小黄瓜连作种植和化学肥料过量施用造成土壤养分失衡、微生物多样性降低、土传病害严重等土壤质量问题，根际促生菌是改善土壤环境质量和提高果实品质的一项重要措施.根际促生菌能显著提高乳瓜产量，增加土壤有机质及有效养分，活化土壤酶系，促进植物生长.本研究是将7种芽孢杆菌属-根际促生菌进行田间筛选试验，由小黄瓜综合评价指数CQI得出：B4(枯草芽孢杆菌)处理对小黄瓜综合效果最佳，对改善土壤根际环境、小黄瓜的品质及产量有积极作用，说明胶质芽孢杆菌具有一定的开发利用潜力，可作为研制小黄瓜生物肥料的优良菌株资源.