合作猪夏冬季的肠道菌群结构

2021-09-22裴利君杨巧丽王鹏飞滚双宝

甘肃农业大学学报 2021年4期

裴利君，杨巧丽，王鹏飞，滚双宝，2

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070；2.甘肃省现代养猪工程技术研究中心，甘肃兰州 730070)

动物的肠道内存在着数量庞大、种类多样的共生微生物群，该群落由细菌、古生菌、病毒、真菌和原生动物组成，其中细菌占主要地位，通常称为肠道菌群[1].肠道菌群与宿主免疫、营养代谢以及其他生命活动紧密相关，如：通过发酵分解食物以及肠道上皮细胞分泌的黏液及形成高效蛋白分解机制等参与机体的消化代谢[2]；通过促进机体的免疫系统发育成熟、形成肠黏膜屏障、维持肠道免疫稳态等维持机体的免疫功能[3]；在肠道与大脑的交互中，通过“菌群-肠-脑轴”调节肠道功能，促进血脑屏障的发育和动物对寒冷环境的适应等[4].肠道菌群在长期进化过程中，通过个体的适应和自然选择，菌群、宿主与环境之间，始终处于动态平衡状态中，相对稳定的微生物菌群对维持机体内环境稳态和健康具有重要意义[5].

肠道菌群与宿主遗传和环境因素有关.研究表明，动物肠道菌群结构受季节、食性、外界环境等的影响.肖文萍[6]研究发现，藏猪夏季和冬季之间肠道微生物相似性仅为0.44，藏猪肠道内优势微生物有30多种，比长白猪肠道内优势微生物(约20种)更具多样性；且藏猪体内具有相对丰富的降解纤维素或半纤维素功能的微生物.白浩男[7]研究发现相比于其他猪种，藏猪肠道中拟杆菌门(Bacteroides)、螺旋体门(Spirochaetes)细菌相对丰度较高，而厚壁菌门(Firmicutes)、肠杆菌科(Enterobacterlaceae)细菌相对丰度较低，其独特的菌群结构可能与其草食、抗病的特性相关.吴丽娟等[8]研究发现藏猪肠道内微生物菌群的复杂多样性在很大程度上源于其食草的特性、特殊的生存环境以及长期散养的饲喂方式.在其他物种上，也有研究表明肠道菌群多样性和组成与其高海拔及寒冷适应性有关.Li等[9]发现，与平原鼠兔相比，高原鼠兔具有多样性更为丰富且植物多糖消化能力较强的肠道菌群以适应高原环境.Li等[10]使用抗生素造成小鼠肠道菌群缺失，发现小鼠体温调控机制受到了破坏，进一步研究发现，肠道菌群的缺失减少了棕色脂肪中UCP-1蛋白的表达量，降低了白色脂肪的棕色化水平，另外该结果在无菌小鼠中也得到了证实，说明肠道菌群在寒冷环境下可对动物的体温调控机制产生影响.由此可见，肠道菌群在机体适应环境变化方面具有重要作用.

合作猪，又称蕨麻猪，是甘肃省高寒牧区放牧或半放牧饲养的一个藏猪类群，主产于甘肃省甘南州的合作、夏河、卓尼、碌曲、迭部等县(市)[11].合作猪生活在青藏高原海拔2 500～3 500 m的低氧环境，以放牧或半放牧方式饲养，春冬季节采食蕨蔴及蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)、苦豆(SophoraalopecuroidesL.)、防风(Saposhnikoviadivaricata(Trucz.) Schisch)、珠芽蓼(PolygonumviviparumL.)等植物的根茎，夏秋季在草原上采食牧草及落果落粒[12].研究高原低氧环境下半放牧饲养合作猪肠道菌群结构对深入了解该品种及其消化道菌群特性具有重要意义.然而，目前关于合作猪肠道菌群的研究鲜有报道.

因此，本项目以合作猪为研究对象，采用16S rRNA高通量测序技术，比较分析甘肃高寒牧区半放牧饲养条件下合作猪夏季和冬季肠道中细菌的多样性和组成差异，深入了解合作猪品种特性，并为后续研究和开发利用合作猪抗寒、抗逆和耐粗饲等优良特性相关的肠菌资源提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 样品采集

于2019年1月(冬季，TW)和2019年8月(夏季，TS)选择在甘肃省甘南藏族自治州夏河县农户半放牧的6月龄健康合作猪，每个季节各6头，共12头.试验猪每日早晨(8∶00)开始放牧，夏季自由采食蕨麻草(Radixpotentillaeanserinae)、车前草(PlantaginisHerba)、野萝卜(RaphanusrapanistrumL.)、野苜蓿(MedicagofaloataL.)、早熟禾(PoaannuaL.)和莎草(CyperusrotundusL.)等野生植物的茎叶和籽实，冬季自由采食蕨麻和野生植物根茎；在傍晚归牧后(夏季20∶00、冬季18∶00)补饲一次，补喂饲料为：草粉0.26 kg/(头·d)、玉米面0.05 kg/(头·d)及青稞面0.18 kg/(头·d).

在猪补喂饲料后排便时，使用无菌棉签收集其新鲜粪便内部未与地面和空气接触的部分作为样品，分装于5 mL无菌离心管中，经液氮速冻后，带回实验室-70 ℃保存.

1.2 粪便细菌总DNA的提取与检测

1.3 16S rRNA基因V3-V4区的扩增与产物回收

选择16S rRNA基因的V3-V4高变区作为扩增和测序的目的片段.以细菌基因组DNA为模板，采用两端带有barcode的特异引物(314F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAAT -3′)进行PCR扩增.PCR产物采用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测；用Invitrogen/QuantiFluorTM-ST荧光定量系统进行PCR产物定量检测.根据所得PCR产物的浓度进行等量混样，重新用2%琼脂糖凝胶电泳检测，并对目的产物条带使用胶回收试剂盒回收.

1.4 文库构建和16S rRNA基因测序

1.5 测序数据处理及统计分析

使用FLASH软件对样品reads进行拼接，得到原始tags数据(Raw tags)，参照Qiime(V1.7.0)的tags质量控制流程对raw tags过滤，得到有效tags数据(Effective tags).以97%的序列一致性水平，利用Uparse软件(Uparse v7.0.1001)对effective tags进行聚类和物种分类分析，生成OTUs；以出现频数最高的序列为OTUs的代表序列，用RDP Classifier(Version 2.2)贝叶斯算法将OTU代表序列与GreenGenes细菌数据库比对进行物种注释，得到对应的物种信息和物种的丰度.

使用Qiime软件统计分析α多样性指数，包括Observed-species，菌群多样性Shannon和Simpson指数，菌群丰度ACE指数.基于各样品序列间的进化信息的差异计算Unifrac距离，采用Qiime软件计算样品间β多样性距离，使用UPGMA算法构建层次聚类树.采用t.test统计方法进行组间样本菌群组成和多样性的差异显著性分析.

2 结果与分析

2.1 OUT统计分析和物种注释

对测序获得的下机数据进行拼接、质控和嵌合体过滤后得到766 363条高质量有效序列(Effective tags)，平均每个样本reads数为63 864，reads的平均长度为412 bp.对所有样品的effective tags以97%的一致性(identity)进行聚类，共获得2 359 OTUs.选取OTUs的代表序列进行物种注释，所有样品共注释了25个门、42个纲、80个目、144个科、249个属和184个种.

得到OTUs后，通过绘制稀释曲线(rarefaction curve)来直接反映测序数据量的合理性，并间接反映样本中物种的丰富程度.如图1所示，所有样品的稀释曲线已经趋于平缓，说明本次试验的数据量可靠.

图1 合作猪肠道菌群稀释曲线Figure 1 The rarefaction curve of intestinal microbiota of Hezuo pigs

2.2 合作猪主要粪便微生物结构组成

合作猪夏季和冬季粪便微生物在门水平排名前10的物种见图2.厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和螺旋体门(Spirochaetes)是组成合作猪冬季和夏季粪便菌群的主要细菌门类，其相对丰度比例占总细菌门95%以上.其他主要细菌门依次为变形菌门(Proteobacteria)、广古菌门(Euryarchaeota)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、软壁菌门(Tenericutes)和蓝藻菌门(Cyanobacteria).

图2 合作猪冬季和夏季肠道菌群主要细菌门的相对丰度Figure 2 Relative abundance of main bacterial phylum of intestinal microbiota of Hezuo pigs between winter and summer

合作猪夏季和冬季粪便微生物在属水平排名前10的物种见图3.在注释的细菌属中，有46个属的相对丰度大于0.1%，约占总细菌比例的16.7%，其中，unidentified_Clostridiales细菌属和Terrisporobacter在夏季合作猪和冬季合作猪中均占有较高比例，但夏季合作猪粪便菌群中乳酸杆菌属(Lactobacillus)和unidentified_Prevotellaceae细菌属的相对丰度较高，分别是冬季合作猪的4.2倍和2.9倍，其他排名前10的主要细菌属有unidentified_Ruminococcaceae细菌属、Romboutsia、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、Acetitomaculum、链球菌属(Streptococcus)、Turicibacter和Lactobacillusnidentified_Clostridiales.

图3 合作猪冬季和夏季肠道菌群主要细菌属的相对丰度Figure 3 Relative abundance of main bacterial genus of intestinal microbiota of Hezuo pigs between winter and summer

2.3 合作猪粪便菌群多样性

夏季合作猪和冬季合作猪粪便菌群α多样性组间差异分析结果见图4.由图可见，合作猪肠道菌群ACE指数、Observed species、Simpson和Shannon指数在冬季与夏季间均差异不显著(P>0.05).

图4 合作猪冬季和夏季肠道菌群α多样性分析Figure 4 The α diversity of intestinal microbiota of Hezuo pigs between winter and summer

基于所有样品的物种注释结果和OTUs的丰度信息，通过样品UPGMA聚类树分析各样本及分组间的相似度，结果发现，同组内样品距离最近(图5-A)，说明组内样品相似度最高；基于weighted unifrace distance的β多样性指数分析发现夏季合作猪β多样性极显著低于冬季合作猪(图5-B)，说明与冬季相比，夏季合作猪个体间粪便微生物群落均匀度较一致.

2.4 合作猪冬季与夏季组间主要差异细菌

采用t.test方法分析门和科水平上合作猪冬季与夏季主要粪便微生物菌群(夏季或冬季的平均相对丰度>0.1%)组成差异，结果见图6.在门水平，冬季合作猪粪便菌群广古菌门(Euryarchaeota)相对丰度显著高于夏季(P<0.05).在科水平，夏季合作猪粪便菌群中链球菌科(Streptococcaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)和消化球菌科(Peptococcaceae)的相对丰度显著高于冬季(P<0.05)，除了普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)外，其他4个细菌科均属于厚壁菌门(Firmicutes)；冬季合作猪粪便菌群中甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)的相对丰度显著高于夏季(P<0.05).

为了进一步挖掘合作猪适应饲草环境变化的主要肠道微生物，我们分析了在种水平上显著差异的细菌(图7)，发现了拟普雷沃菌309(Alloprevotella_sp_feline_oral_taxon_309)、梭菌目细菌ID5(Clostridium_sp_ID5)、柏林密螺旋体(Treponema_berlinense)和溶纸梭菌(Clostridiumpapyrosolvens)在夏季合作猪粪便菌群中的相对丰度均显著高于冬季(P<0.05)；反刍甲烷杆菌(Methanobrevibacter_ruminantium)、瘤胃菌属细菌YS3(rumen_bacterium_YS3)以及毛螺旋菌科细菌YE64(bacteriumYE64)在夏季合作猪粪便菌群中的相对丰度均显著低于冬季(P<0.05).

图6 合作猪冬季和夏季组间显著差异主要细菌门和细菌科Figure 6 The main bacterial phyla and bacterial families with significant differences of Hezuo pigs between winter and summer

3 讨论

合作猪是我国高原型地方猪种藏猪的一个类群，因其常年在甘肃省高寒牧区放牧或半放牧饲养，形成了耐粗饲、耐低氧和高寒以及抗病力强的特点.本研究样品采集地点为甘南藏族自治州西北部夏河县，属大陆高原性气候.7月(夏季)均温为12.7 ℃，处于全年降水集中期，气候潮湿，植被丰富，蕨麻猪主要采食各种牧草、植物的青绿茎叶及落果籽实；1月(冬季)均温为-9 ℃，处于枯草期，气候寒冷，牧草资源较为缺乏，合作猪主要采食蕨蔴及蒲公英、苦豆、防风、珠芽蓼等植物的根茎[13-16].本研究对6月龄合作猪夏季和冬季粪便菌群多样性和组成进行分析发现，合作猪夏季和冬季粪便菌群α多样性差异不显著(P>0.05)，而夏季合作猪粪便菌群β多样性显著低于冬季(P<0.05)，这与李卓君[17]的研究结果一致，其原因可能与合作猪冬春季采食蕨蔴、草根，夏秋季在草原上采食牧草及落果落粒的特性有关，合作猪可能通过丰富肠道菌群的多样性来提高冬季对高纤维饲料的消化利用能力；也可能是合作猪对冬季冷适应的表现，有研究表明，降低环境温度后，布氏田鼠不仅增加了摄食量和产热，同时改变了肠道菌群的结构来抵抗寒冷[4].对合作猪夏季和冬季肠道菌群组成分析发现，在门水平，合作猪夏季和冬季粪便菌群中优势菌门的分布基本相同，按相对丰度大小依次为厚壁菌门、拟杆菌门和螺旋体门，这3个细菌门占合作猪粪便总细菌的比例分别为66.76%、27.11%、4.65%，这与王芳等[18]、Shang等[19]的研究结果一致.然而，在Jiang等[20]的研究中，6月龄时藏猪粪便菌群中拟杆菌门比例最高，其次是厚壁菌门，分别约占总细菌数的50%和30%左右，这种结果差异可能与试验猪种饲养环境和饲养方式不同有关.厚壁菌门(Firmicutes)是猪正常肠道菌群的一大类细菌[21]，该细菌门的主要成员能通过碳水化合物代谢产生短链脂肪酸，在机体能量获得和免疫应答调节中发挥重要作用[22-23].拟杆菌门(Bacteroidetes)是肠道革兰氏阴性菌中数量最大的一类细菌[24]，该细菌门的主要成员具有较强的分解多糖的能力[25].螺旋体门(Spirochaetes)也是成年猪肠道菌群的主要细菌门类之一，能够降解果胶、纤维素和磷酸酯等，发酵碳水化合物生成短链脂肪酸为动物机体提供能量[26].在属水平上，梭菌属(unidentified_Clostridiales)和Terrisporobacter为合作猪粪便菌群中的优势细菌属，其他主要细菌属有unidentified_Ruminococcaceae细菌属、Romboutsia、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、Acetitomaculum、链球菌属(Streptococcus)、Turicibacter和Lactobacillusnidentified_Clostridiales.除归属于厚壁菌门消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)的Terrisporobacter和Romboutsia外，其他几种细菌被报道在藏猪和民猪粪便细菌属中占主要比例[17,27].说明这些菌群可能与合作猪能够消化利用粗饲料的特性有关.与冬季合作猪相比，夏季合作猪粪便菌群中乳酸杆菌属(Lactobacillus)和unidentified_Prevotellaceae细菌属的相对丰度较高，这可能与合作猪不同季节的采食变化相关.unidentified_Prevotellaceae细菌参与淀粉的降解，与葡萄糖代谢呈正相关，具有分解黏蛋白质、降解多糖的功能[28]；乳酸杆菌属(Lactobacillus)是重要的益生菌，不仅可以调节肠道菌群平衡维持肠道健康发育抑制有害菌生成，还能够有效分解食物中的蛋白质和糖类，合成维生素，而且对脂肪也有微弱的分解能力，从而可以促进消化吸收[29].因此我们推测，在夏季，较丰富的乳酸杆菌(Lactobacillus)和unidentified_Prevotellaceae有利于合作猪在夏季对牧草落果、落粒等食物中的淀粉、糖类和蛋白的降解.在种水平上，我们发现，拟普雷沃菌309(Alloprevotella_sp_feline_oral_taxon_309)、梭菌目细菌ID5(Clostridium_sp_ID5)、Treponema_berlinense和溶纸梭菌(Clostridiumpapyrosolvens)在夏季合作猪粪便菌群中的相对丰度均显著高于冬季合作猪(P<0.05).其中，溶纸梭菌(Clostridiumpapyrosolvens)是一种厌氧纤维素降解细菌，能产生具有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶活性的纤维小体，高效地降解果胶质、蛋白质和纤维类物质[30].反刍甲烷杆菌(Methanobrevibacter_ruminantium)、瘤胃菌属细菌YS3(rumen_bacterium_YS3)以及毛螺旋菌科细菌YE64(bacteriumYE64)在夏季合作猪粪便菌群中的相对丰度均显著低于冬季(P<0.05).其中，毛螺旋菌科细菌具有降解毒素、抵制致病菌感染的作用[31]，有利于合作猪在冬季疾病高发期提高对病原菌的抵抗力；瘤胃菌属细菌是主要分布于食草动物体内具有分解纤维素能力的细菌[32]；甲烷杆菌(Methanobrevibacter_ruminantium)在单胃动物后肠的微生物发酵中起着重要的作用，其能利用微生物发酵产生的氢和二氧化碳生成甲烷，从而使后肠维持较低的氢气压，并促进有机物质的降解[33].说明这些菌群有利于提高合作猪对冬季高纤维性食物的消化，获取更多的能量满足在寒冷的气温下自身产热的需要.