婴幼儿配方乳粉叶黄素含量检测不确定度的评定

陈 忱

北大荒完达山乳业股份有限公司质检中心，黑龙江哈尔滨 150000

0 引言

目前，国家对于婴幼儿配方乳粉（简称“婴配粉”）的监管日益严格[1]，尤其对于叶黄素这类极易降解、添加的营养强化物质含量，抽检频次要求更为频繁[2，3]。对于不同的检测方法，在其检测过程中总会引入A类不确定度和B类不确定度，A类不确定度主要来源是测量重复性相对标准不确定度Urel Xrep()和多次测量试样质量的相对标准不确定度Urel m2()。而B类不确定度则包含的比较广泛，主要包括工作曲线相对标准不确定度Urel X()，称量相对标准不确定度Urel m1()，样品定容体积,的相对标准不确定度Urel V()，标准溶液相对标准不确定度Urel I()等。本文则是针对《GB5009.248—2016 食品安全国家标准 食品中叶黄素的测定》方法，对检测过程中可能出现不确定的过程进行数学建模[4]，最终获得婴配粉中叶黄素含量的不确定度[5]，为检测数据的准确性提供更加详实的基础。

1 原理与方法流程

1.1 方法原理

脂肪含量高（脂肪含量以干基计，不低于3.0%）的食品经氢氧化钾溶液室温皂化使叶黄素游离后，再以乙醚-正己烷-环己烷（40∶40∶20，体积比）提取，液相色谱法分离，紫外检测器或二极管阵列检测器检测，外标法定量[6]。样品在提取与分析过程中，反式结构的叶黄素可能发生异构化，转化为顺式叶黄素。对于转化产生的顺式叶黄素，可通过保留时间定性、峰面积加合定量。

1.2 操作步骤

准确称取2 g（精确至0.01 g）均匀试样于50.000 mL聚丙烯离心管中，加入约0.2 g二丁基羟基甲苯（BHT）和10.000 mL乙醇，混匀，加入10.000 mL10.0%氢氧化钾溶液，涡旋振荡1 min混匀，室温避光振荡皂化30 min，以10.000 mL萃取溶剂避光涡旋振荡提取3 min，4500 r/min离心3 min，重复提取2 次。合并提取液，以10.000 mL水洗涤，4500 r/min离心3 min分层，重复洗涤1 次，合并有机相于室温减压浓缩至近干，以0.1% BHT 乙醇溶液涡旋振荡溶解残渣并定容至5.000 mL，过0.45 μm 滤膜，供液相色谱测定。

液态奶：准确称取10 g（精确至0.01 g）样品于50.000 mL聚丙烯离心管中，加入约0.2 g BHT和10.000 mL乙醇，混匀，加入2.000 mL20.0%的氢氧化钾溶液，涡动1 min混匀，室温避光振荡皂化30 min，以10.000 mL萃取溶剂避光涡旋振荡提取3 min，4500 r/min离心3 min，重复提取2 次。合并提取液，以10.000 mL水洗涤，4500 r/min离心3 min分层，重复洗涤1 次，合并有机相于室温减压浓缩至近干，以0.1%BHT乙醇溶液涡旋振荡溶解残渣并定容至25.000 mL，过0.45 μm 滤膜，供液相色谱测定。在操作过程中，需要注意的是，由于叶黄素对光敏感，除非另行说明，所有试验操作应在无500 nm以下紫外光的黄色光源或红色光源环境中进行。

2 数学模型

试样中叶黄素的含量按下式计算：

式中：X 为试样中叶黄素的含量，单位为μg/100 g；c为由标准曲线而得的样液中标准品的含量，单位为μg/mL；V为样品最终定容体积，单位为mL；m为称样量，单位为g；F为校正系数。

可通过以下方式获得：用液相色谱分析试样溶液，将顺式与反式叶黄素色谱峰面积加合作为总峰面积，其中反式叶黄素峰面积除以总峰面积所得值为校正系数。计算结果保留3 位有效数字。

3 各量值及其不确定度评定

公式1中的各量值见表1。

表1 量值及其不确定度

用液相色谱法测定浓度，为了校准液相色谱仪器，采用叶黄素标准储备液浓度为20.8575 μg/mL 配制6 种标准溶液，其浓度分别为0.3337 μg/mL、0.6674 μg/mL、1.3349 μg/mL、2.0023 μg/mL、2.6698 μg/mL、3.3372 μg/mL。用液相色谱法对6 种浓度溶液进行含量测定，每个浓度测定3 次，结果见表2。

表2 各浓度下测量叶黄素含量量值

3.1 浓度的不确定度

浓度的不确定度有两部分构成，一是由于6 种浓度标准溶液拟合的线性方程求得的浓度时测量产生的不确定度；二是由标准储备液配制成6 种浓度标准溶液时所产生对浓度的测量带来的不确定度。

3.1.1 浓度的线性方程引起的不确定度

根据表1，数据拟合得到如下线性方程：y=0.7108x+0.0180，其中x为溶液含量，y为峰面积比，对一定浓度的标准溶液进行2 次重复测量，通过线性方程求得待测样品x=1.6426 μg/mL，则x的标准不确定度为[7]：

式中，n=18（n为标准系列点数6，重复次数3 次）；P 为待测样品的重复测定次数，P=2；X为待测样品浓度的平均值1.6426 μg/mL（1.6425 μg/mL，1.6427 μg/mL）；C0为标准系列各点浓度的平均值1.7242 μg/mL）；C0i为各标准液浓度；b为标准曲线斜率0.7108；a为截距0.0180；yi为各标准液的面积比。

根据以上数据，由公式6计算得U（x）=0.0181 μg/mL，标准曲线拟合引入的相对标准不确定度为：

3.1.2 配标准溶液所产生的不确定度

（1）标准品的称量引入的不确定度

电子天平准确称取1.05 mg叶黄素标准品，所使用天平精密度为0.01 mg，包含因子因此，天平的标准不确定度为：

（2）标准品的定容引入的不确定度

配置叶黄素的标准储备液采用的容量瓶在20 ℃时的体积为50.00 mL，按照《JJG196—2006 常用玻璃量具检定规程》的要求，经查询，50.00 mL容量瓶的允差为±0.05 mL，包含因子其标准不确定度Uc（B2）为：

（3）标准溶液稀释过程温度对容量瓶引入的不确定度

配制标准储备液中采用的容量瓶已在 25 ℃时校准，而实验室的温度也控制在（20±5）℃。由温度波动引起的不确定度可通过估算温度范围和体积膨胀系数进行计算，液体的膨胀系数远高于玻璃的膨胀系数，所以玻璃的膨胀系数可忽略。标准工作液是用甲醇配制，甲醇的体积膨胀系数为0.0012 ℃-1，产生的体积变化为：（5010.0012 ℃-1=0.06 mL，则区间半宽度a2=0.06 mL设为均匀分布，包含因子工作液配置过程中用到了6 个10.000 mL容量瓶，（1060.0012 ℃-1=0.072 mL，则区间半宽度a2=0.072 mL设为均匀分布，包含因子k=其标准不确定度Urel（B3）为：

（4）标准溶液稀释过程移液管引入的不确定度

吸取叶黄素标准储备液稀释到标准溶液的过程所用为移液管，吸取不同浓度的标准溶液时所选用的1.000 mL（2 次）、2.000 mL（1 次）、5.000 mL（1 次）、10.000 mL（1 次）的移液管来吸取标准溶液0.0958 μg/mL，0.1915 μg/mL，0.3831 μg/mL，0.7661 μg/mL，1.5323 μg/mL，1.9153 μg/mL。根据 SGCR-3-535 批次胖肚移液管的校正说明书，得到以下规格移液管的偏差范围，根据均匀分布，包含因子移液管量取体积和次数的不确定度分别见表3、4。

由表3和表4，根据公式可得：

表3 移液管量取体积的不确定度

表4 移液管量取次数的不确定度

3.2 质量的不确定度

质量的不确定度主要有两个方面，一是所用天平的不确定度，二是多次测量引入的不确定度。天平制造商给出了±0.10 mg 的线性分量，该数值代表了托盘上被称量的实际重量与从天平所读取的数值的最大差值。线性分量被假设成矩形分布，换算成标准不确定度为：

上述分量必须计算二次，一次作为空盘，另一次为毛重，因为每一次称重均为独立的观测结果，两者的线性影响不相关，因此，由天平引起的标准不确定度为：

称样量为2.0000 g，则相对不确定度为：Urel（m1）=0.0816/2103=0.0000408

对样品重复测量10 次引入的不确定度为A类分量，区次测量结果分别为2.0002 g，2.0005 g，2.0009 g，2.0004 g，2.0005 g，2.0003 g，2.0008 g，2.0007 g，2.0007 g，2.0002 g。

3.3 结果的不确定度评定

在重复性条件下，对试样进行了10 次独立测试值（μg/100 g）：

标准偏差S=0.675 μg/100g，则算术平均值的不确定度为：

由测量重复性引入的相对不确定度：

3.4 体积的不确定度评定

样品定容采用在20 ℃时的5.00 mL吸管，按照《JJG 196—2006 常用玻量具检定规程》的要求，经查询，5 mL 吸管的允差为±0.025 mL，包含因子 k=其标准不确定度uc（v）为：

4 合成相对标准不确定度评定

合成相对标准不确定度Urel的计算：

5 结论

扩展不确定度评定U c（X）=Urel（X）X=0.012234.3 μg/100g=2.8116 μg/100 g，取置信因子k=2（P约为95.0%）扩展不确定度为U扩展=kUc（X）=5.62 μg/100g，故当多次试验数据的所测样品中叶黄素结果为234.30 μg/100g 时，测量结果为：X=（234.30±5.62）μg/100 g。结论在叶黄素含量测定过程中，标准溶液浓度引入的相对不确定度是影响测量乳粉重叶黄素含量不确定度的主要因素[8]。