四川凉山地区奶牛乳房炎主要病原菌分离鉴定及药敏情况分析

周国燕，陈鲁喜，孙 艳，万 杰，陈 彬，张 涛＊，安拉扎，仇剑宇

1 凉山彝族自治州畜牧兽医科学研究所，四川西昌 615000

2 凉山科华奶牛繁育有限公司，四川西昌 615042

3 四川农业大学，四川雅安 625000

0 引言

乳房炎是困扰奶牛养殖场最常见且最具挑战性的疾病之一[1]，几乎所有奶牛场均有发病史。因奶牛的乳腺具有特殊结构，其在受到物理、化学、微生物等刺激时容易产生炎性变化而发生临床型乳房炎或隐性乳房炎，不仅使产奶量和乳品质降低，还会引起奶牛产后发情周期延迟、生殖机能受损、生产性能降低，造成严重经济损失，并且乳房炎感染的某些病原菌还严重威胁人类健康[2]。相关研究显示，全球2.2 亿头奶牛中约1/3患有不同程度的乳房炎疾病，造成的经济损失可达30 亿美元，我国每年约花费2080 万美元用于奶牛乳房炎的防控[3]。据项目组调查，四川凉山地区奶牛乳房炎每月最高隐性发病率高达70.0%，月最高临床发病率达15.3%，远高于国家标准2.0%的临床发病率，严重影响本地区奶牛产业健康发展。在奶牛场中，乳房炎不仅发病率高，而且已知病原菌感染种类多达百余种[4]，并且病原菌在牛群、地区存在区系分布差异，病原菌流行株不尽相同，不同地区细菌分离率也不同。受生产管理、兽医技术水平、抗生素用药规范程度等影响，长期乳房炎抗生素治疗使不同地区菌群药物敏感性发生较大的差异[5]。

为了掌握本地区乳房炎病原菌流行情况及耐药情况，项目对凉山地区乳房炎牛只进行病原菌的分离与鉴定，并测定病菌的药物敏感特性，筛选出敏感的抗菌药物，为凉山地区奶牛乳房炎的有效防治提供科学依据；同时为开展奶牛乳房炎进一步治疗以及耐药基因、耐药原因的研究奠定基础[6，7]。

1 材料

1.1 样品及质控菌株

2020年9月至2021年2月期间，在凉山州奶牛主要养殖区的不同规模养殖场采集临床型和CMT隐性乳房炎样本（＋＋以上），共193 例奶牛乳汁作为试验样品，进行细菌分离鉴定及药敏试验。质控菌株大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATTCC25923由四川农业大学动物医学院新兽药安全评价实验室保存提供。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 培养基

LB肉汤、高盐肉汤培养基、SC肉汤培养基、普通营养肉汤、乙基紫肉汤培养基、MHB肉汤培养基、高盐-甘露醇琼脂培养基、血琼脂平板培养基、普通营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、SS琼脂培养基。

1.2.2 抗菌药物

阿莫西林、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻呋、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、多西环素、环丙沙星、氧氟沙星、克林霉素、氟苯尼考、红霉素、青霉素。

1.2.3 其他试剂

红四氮唑（TTC）、革兰氏染液套装、0.5麦氏比浊管、丙三醇、氯化钠、肠杆菌科生化鉴定管（11 种）、葡萄球菌属生化鉴定管（16 种）、链球菌属生化鉴定管（11 种）、绿脓杆菌生化鉴定盒（5 种）、细菌16S rDNA的通用引物。

1.2.4 主要仪器

立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-50FBS）、微量加样器、超净工作台、恒温培养箱、

数显恒温水浴锅、气浴恒温振荡器、电热鼓风干燥箱（101-4）、光学显微镜、电子分析天平、高速冷冻离心机（J-26XP）、旋涡混合器（XW-80A）。

1.3 试验方法

1.3.1 细菌分离

将不同奶牛场的患病奶牛乳汁接种于LB肉汤培养基、SC肉汤培养基、乙基紫肉汤培养基、高盐肉汤培养基，进行细菌增菌培养；取适量培养出的菌液分别在伊红美蓝琼脂培养基、SS琼脂培养基、血琼脂平板培养基、高盐-甘露醇琼脂培养基表面划线纯化培养，挑取纯化后的单菌落进行增菌培养。

1.3.2 细菌鉴定

挑取纯化后的可疑单菌落接种于各类培养基中，观察其菌落形态及培养基颜色变化；并将待检菌株接种于各类培养液中，取出一接种环进行革兰氏染色镜检；将待检菌株进行生化鉴定，对生化鉴定不确定菌株进一步做细菌16S rDNA进行PCR扩增及测序。

1.3.3 药物敏感性检测

根据CLSI所推荐的微量肉汤稀释法对分离的菌株进行14 种药物的敏感性检测。结果MIC值参照CLSI（2020）和EUCAST（2019）折点值范围进行判定。

2 试验结果

2.1 细菌检出情况

试验采集检测的193 份样品中有134 份检出病原菌，检出率69.4%；其中65 份检出两种及两种以上菌，占检出数的48.5%。值得注意的是，在检测的32 份隐性乳房炎样品中，病原菌的检出率为68.7%，两种及两种以上菌占检出数的40.9%（表1）。

表1 乳房炎奶样的培养鉴定结果

2.2 细菌分离情况

试验采集检测的193 份样品分离出菌株12 种234 株，包括革兰氏阴性菌131 株，革兰氏阳性菌103 株。其中分离率较高的前六种菌分别是：大肠杆菌56 株，分离率23.8%；肺炎克雷伯菌42 株，分离率17.9%；葡萄球菌63 株，分离率26.9%；肠球菌24 株，分离率10.3%；链球菌13 株，分离率5.6%；荧光假单胞菌10 株，分离率4.3%（表2）。葡萄球菌属最高分离率达26.9%，分离到该属多种葡萄球菌，其中金黄色葡萄球菌17 株，分离率7.26%。

表2 菌株分离情况

2.3 病原菌药物敏感性测定结果

通过最小抑菌浓度试验结果显示，质控菌大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923对14种抗菌药的MIC值均在质控范围内，表明数据真实可信。对本研究分离到的大肠杆菌、葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等12 种菌中的10 种细菌药敏试验结果显示，不论是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌对试验选取的17 种常见抗生素均表现不同程度的耐药，有部分菌株还表现严重的多重耐药。有些菌株对部分药物耐药率达100%。

56 株大肠杆菌对抗菌药的敏感性有所不同，对阿莫西林、克林霉素耐药率较高，分别为73.2%和67.3%，其次是多西环素、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻呋、氟苯尼考、链霉素，耐药率在21.5%～33.9%，对环丙沙星较为敏感，耐药率约为10.7%；对氧氟沙星不耐药。

葡萄球菌对大多数药敏感性都不高，尤其是青霉素、头孢曲松，耐药率达到66.7%和60.3%；对环丙沙星和氧氟沙星敏感性较高，分别为4.8%和6.3%，对其他药物耐药率介于19.0%～57.4%之间。

肺炎克雷伯菌对阿莫西林和氨苄西林、克林霉素、磺胺异恶唑高度耐药，达97.6%、90.9%、98.9%和87.5%；对环丙沙星比较敏感，耐药率为4.8%；对氧氟沙星不耐药；对其他药物耐药率在11.9%～40.5%之间（表3、4）。

表3 病原菌药物敏感检测结果

3 分析与讨论

3.1 凉山地区乳房炎病原菌检出率

奶牛乳房炎一直是困扰世界奶牛业的常见疾病，因为导致奶牛乳房炎的病因非常复杂，有机械损伤、环境性病原菌、传染性病原菌等，有研究表明目前能够导致奶牛乳房炎的致病菌可达数百种[4]。本次试验193 份样品中，通过分离鉴定有134 份样品检出病原菌，检出率达69.4%，其中65 份还检出两种及两种以上菌，占检出数的48.5%。某些病原菌如奇异变形杆菌、绿脓杆菌、肠球菌等为条件性致病菌，在乳房受损、机体抵抗力下降、传染性病原菌感染时容易引发乳房炎，这表明混合感染是引起凉山地区乳房炎的原因之一，也是临床上治愈困难、病情反复的原因之一。该研究所采集的临床型乳房炎样品中，有30.4%的样品未检出病原菌，张俊杰等[8]曾报道大部分牧场在对全部临床型乳房炎奶样进行病原菌培养时，会发现无细菌生长的比例大约占30.0%，而这30.0%的无菌生长病例可能意味着此阶段免疫系统已经成功将所感染的病原菌清除，或是因为其他非病原菌因子（病毒、真菌等）所致。在本研究中检出无菌的比例也刚好是30.4%，如果在揭发乳房炎时，机体的免疫系统已经成功清除细菌感染，诊断到的只是机体自身的炎症反应，那么常规治疗中看到临床型乳房炎症状就使用抗生素治疗就是值得反思的，存在一定的不合理性。也可能这些未检出菌样本是因为其他致病因子（病毒、真菌等）造成，所以本试验方法不能检出。

3.2 凉山地区奶牛乳房主要病原菌种类

本次研究在凉山地区不同养殖规模、不同管理水平的牧场中，对采集的193 份临床型乳房炎和隐性乳房炎样品进行细菌分离鉴定，共分离到12 种234 株病原菌。结果表明，目前在该区引起乳房炎的主要病原菌主要以葡萄球菌（26.9%）、大肠杆菌（23.8%）、肺炎克雷伯氏菌（17.9%）、肠球菌（10.3%）及链球菌（5.6%）为主，占检出细菌的84.62%，其中葡萄球菌属、大肠杆菌及肺炎克雷伯氏菌为优势菌群，这与我国其他地方及国外学者的报道有相同之处[9～11]。张明国等[12]曾抽检了凉山地区90 余份奶样，检出病原菌多达17 种，其中大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、绿脓杆菌、枯草芽胞杆菌、奇异变形杆菌、肠球菌在本次试验中仍然检出，而且部分菌还有较高检出率。这一结果提示，奶牛乳房炎防治是一个长期的过程，区系菌群在保持相对的稳定状态中又会有新的菌群增加，如肺炎克雷伯氏菌。故乳房炎防治中需依靠科学检测手段来指导防控，而非经验。在加强传染性病原菌控制的同时，对环境型病原菌的控制须更具针对性，环境型病原菌的治理才是改善该区乳房炎多发常发的根本。

本研究中32 份隐性乳房炎样品的病原菌检出率为68.7%，两种及两种以上菌占检出数的40.9%，说明了牛场开展CMT检测工作的必要性，检测出＋＋以上的牛只应及时进行隔离治疗，防止隐性乳房炎转化为临床型乳房炎。项目组下一步将持续关注对CMT阳性样本的检测。

3.3 环境性病原菌防控措施

本研究中大肠杆菌分离率高达23.8%，肺炎克雷伯菌分离率达17.9%。近年来，随着奶牛集约化养殖模式的推广以及规范化挤奶程序、干奶期治疗和现代化管理方式的应用，传染性乳房炎病原菌的检出率有所下降。本研究中金黄色葡萄球菌分离率为7.30%，明显低于环境性乳房炎病原菌的分离率。环境型病原菌导致乳房炎的主要原因是环境管理不当，牛舍内潮湿、粪便积累、运动场淤泥、通风不良等应激因素，或是奶牛自身体质下降，乳房表面有损伤等诱发因素时，病原菌突破乳房屏障定植于乳腺可引起奶牛乳房炎。比如大肠杆菌引起乳房炎时，虽然机体可吞噬杀灭感染的大肠杆菌但产生的大量内毒素对牛体产生严重影响[2]。而在本研究中笔者曾采集牛场粪样检测，几乎全部粪样中均检出大肠杆菌。所以在该区要减少大肠杆菌引起的乳房炎，必须制定切实有效的粪污管理办法，保证牛床干燥整洁，减少蚊蝇滋生，特别加强垫料粪污管控，减少接触将是行之有效的方法。

3.4 减少该地区乳房炎主要病原菌产生耐药性措施

在本研究中不论是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌，对试验选取的17 种常见抗生素均表现不同程度的耐药，有部分菌株还表现严重的多重耐药，有些菌株对部分药物耐药率达100%。究其原因，现阶段本地区乳房炎治疗仍以抗生素为主，科学的抗生素使用方法须先对乳房炎阳性牛进行病原菌分离，然后进行药敏试验，筛选有效抗生素进行治疗。但是，凉山地区多数中小型奶牛场根本无条件在场内开展检测工作，长期的抗生素应用没有针对性，或者本身已经产生耐药了而还在使用，从而导致耐药菌株甚至超级细菌的出现。要解决该问题，需定期开展相应的试验检测，进行指导性用药，在临床用药中尽可能选择窄谱的低耐药性抗生素；在选择药物时，严格遵循药物适应症；交替循环使用常用的抗生素，在一种药物产生耐药后暂停使用或换为另一类抗菌机制不同的药物，则细菌对药物产生的耐药会逐渐消退；还应注意科学的用药剂量和用药疗程，随意改变剂量和疗程也是抗生素产生耐药的原因[4]。

3.5 建议新的乳房炎防治办法

本研究中不论是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌，对β-内酰胺类和林可胺类抗生素普遍耐药，耐药率均在50%以上，甚至全部耐药；对喹诺酮类抗生素敏感性较高，敏感率基本达到80%以上。据奶牛场现场调查，β-内酰胺类和林可胺类确实为目前场内使用较多的药物，在今后临床用药中需谨慎选择使用，可考虑使用喹诺酮类抗生素来达到治疗效果。在其他疾病治疗方面，越来越多的中药及中成药得以大量应用，在后期可更多尝试。张鹏举等[13]使用公英翘芦散治疗乳房炎7 天，治愈率达到62.67%，有效率达到90.67%。陆福强等[14]使用中药组方黄芪100 g、党参80 g、川芎75 g、白术30 g、黄连60 g，将中药组合为1 个剂量，并在此基础上以10 倍水进行煎制，在1.5 h后取中药汤剂，剩余的残渣可以加入8 倍水继续煎制约1 h，将汤剂进行混合，内服，每天1 剂，治疗奶牛乳房炎取得显著效果。受本区域气候、地理环境、病原菌区系菌群等多方因素影响，如能在凉山筛选出适宜于本地域的奶牛乳房炎防治方剂，将大大降低抗生素的使用，为乳品安全提供保障。