lncRNARP11-169D4.1-001对喉鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响

郝文娟 沈志森 周重昌 李群 邓红霞

喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）占喉癌的96%以上，是头颈癌中最常见的恶性肿瘤之一[1]。根据我国癌症统计数据，2015年喉癌新增患者约26 300例，死亡14 500例[2]，且喉癌发病率男性明显多于女性（比例约为4∶1）[3-4]。活检病理结果是LSCC诊断的金标准，CT、MRI和PET用于肿瘤分期。但喉癌的初期症状容易被忽视，如声音嘶哑、发声困难、呼吸困难等，60%的患者在确诊时已处于晚期（Ⅲ期或Ⅳ期）[5]。由于喉的特殊解剖结构和不可替代的功能，术后发声困难、吞咽困难和永久性气管造瘘对患者的生活质量有重要影响[6]。研究人员致力于寻找无创的诊断和治疗方法。有报道称长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）在LSCC的发生、发展和转移中起关键作用[7]。lncRNA定义为一类长度超过200 bp且不编码蛋白的转录本，在肿瘤中的差异表达可能是肿瘤诊断和预后评估的生物标志物[8]。笔者团队发现lncRNA RP11-169D4.1-001在LSCC肿瘤组织中表达下调[9]。不仅如此，RP11-169D4.1001表达下调与患者颈淋巴结转移、预后和生存时间显著相关[9]。本研究进一步通过细胞实验来探讨RP11-169D4.1-001对LSCC细胞增殖、凋亡、迁移等生物学行为的影响，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 细胞来源和培养 本实验使用两株LSCC细胞，其中AMC-HN-8购自苏州北纳保藏中心，使用含10%FBS的DMEM（高糖）培养基进行培养；TU-212购自广州基迪奥生物科技公司，使用含10%FBS的RPMI1640培养基进行培养，培养于37℃含5%CO2培养箱。当贴壁细胞融合度约达90%以上时，给予细胞传代处理，以防细胞之间发生接触抑制。弃去培养瓶中旧的培养基，加入2 ml PBS漂洗2～3遍。弃去PBS，再加入适量的含0.25%EDTA的胰蛋白酶，使其完全覆盖瓶底。将培养瓶放置于细胞培养箱中，待细胞变圆、开始从瓶底脱落的时候，加入2 ml完全培养基终止消化。用吹打管将少许黏附在瓶底的细胞吹落，并将细胞团吹散制成单细胞悬液。取适量细胞悬液放入新的培养瓶中，加入完全培养基。瓶体标明细胞名称及传代时间，继续放置在细胞培养箱中培养待用。

1.2 细胞转染 过表达RP11-169D4.1-001的慢病毒载体LV5-RP11-169D4.1-001及其空载对照LV5-NC购自中国吉玛公司，滴度高达5×108TU/ml。根据细胞复染指数，向细胞培养基中加入适量体积的病毒液，并使用聚凝胺（5 μg/ml）促进病毒转染的效率，放在水平摇床上将板内溶液混合均匀。经转染，AMC-HN-8和TU-212细胞均分为稳定过表达RP11-169D4.1-001的LV5-RP11-169D4.1-001组及其对照LV5-NC组，将两组细胞株置于培养箱中继续培养，用于后续实验。

1.3 转染后LSCC细胞RP11-169D4.1-001表达水平检测 采用qRT-PCR法。细胞的总RNA使用Trizol试剂（美国Invitrogen公司）提取。采用DS-11 Plus分光光度计（美国丹诺尔公司）测定总RNA浓度，A260/A280和A260/A230的比值判断提取RNA的纯度。琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。取2 μg总RNA，用GoScriptTM逆转录系统试剂盒（美国Promega公司）进行逆转录反应。以逆转录得到的cDNA为模板，与GoTaqqPCR Master Mix试剂盒（美国Promega公司）和引物反应，检测目的基因水平。所有反应均在Mx3005P QPCR系统（美国Stratagene公司）上进行，RP11-169D4.1-001的相对表达水平通过GAPDH进行标准化。引物由上海生工生物技术有限公司合成，RP11-169D4.1001引物序列：正义链 5'-TCTCACTAAGGTAGAACTGATGGGC-3'，反义链5'-GACTCCTCAGGGAAAATGGAAACT-3'；GAPDH 正义链 5'-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3'，反义链 5'-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3'。

1.4 转染后LSCC细胞增殖及细胞克隆形成实验 采用实时细胞分析仪（美国艾森生物科学公司）检测RP11-169D4.1-001对LSCC细胞增殖的影响。96 h实时监测细胞指数（cell index,CI）以评估细胞增殖率。采用细胞克隆形成实验检测细胞的克隆形成率，将细胞接种于6孔板（1 000细胞/孔）；14 d后，使用4%多聚甲醛固定菌落，0.1%结晶紫染色，拍照，计数。细胞的克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

1.5 转染后LSCC细胞周期与凋亡分析 将细胞接种于6孔板。细胞附着后，将完全培养基改为无血清培养基，使G0期细胞周期同步。细胞饥饿24 h后换回完全培养基，继续培养24 h。然后收集细胞，使用周期试剂盒（杭州联科公司）进行染色，FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）分析样本。每个样本获取20 000个细胞，使用Modifit软件（美国BD公司）分析细胞周期的分布。细胞凋亡分析用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(杭州联科公司)进行染色。使用FlowJo 7.6.1软件分析流式细胞仪检测的细胞凋亡谱。

1.6 转染后LSCC细胞迁移实验 使用划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移能力。划痕实验时将细胞接种于培养皿中，其融合度达到90%以上时用吸管头划痕，并换无血清培养基培养24 h，根据划痕面积计算相对迁移率，用Image J软件（美国国立卫生研究院）测量划痕面积。Transwell实验时下室加入完全培养基，上室接种无血清培养基；24 h后用4%多聚甲醛固定在膜上，然后用0.1%结晶紫（德国Sigma公司）染色并在显微镜下拍照。

1.7 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件。实验至少独立重复3次。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染不同慢病毒载体LSCC细胞RP11-169D4.1-001表达水平比较 在AMC-HN-8和TU-212两株LSCC细胞中，LV5-RP11-169D4.1-001组 RP11-169D4.1-001表达水平均显著高于LV5-NC组，见图1。

图1 转染不同慢病毒载体喉鳞状细胞癌（LSCC）细胞RP11-169D4.1-001相对表达水平比较（与LV5-NC组比较，***P＜0.001）

2.2 转染不同慢病毒载体LSCC细胞增殖能力和克隆形成率比较 细胞增殖实验显示，与LV5-NC组细胞相比，RP11-169D4.1-001组细胞增殖能力下降（P＜0.05），细胞生长曲线见图2。细胞克隆形成实验显示，与LV5-NC组细胞相比，RP11-169D4.1-001组细胞克隆形成率下降（P＜0.05），见图 3（插页）、4。即 RP11-169D4.1-001在LSCC细胞增殖和细胞克隆形成中发挥抑制作用。

图2 转染不同慢病毒载体喉鳞状细胞癌（LSCC）细胞生长曲线比较（与 LV5-NC 组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）

图3 两组喉鳞状细胞癌（LSCC）细胞克隆形成后肉眼所见（0.1%结晶紫染色，×1）

图4 转染不同慢病毒载体喉鳞状细胞癌（LSCC）细胞克隆形成率比较（与 LV5-NC 组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3 转染不同慢病毒载体LSCC细胞周期分布与凋亡情况比较 流式细胞术分析结果显示，RP11-169D4.1-001组细胞周期阻滞在G0/G1期，S期占比下降，见图5。其中S+M期占比可代表细胞的增殖率，可见RP11-169D4.1-001抑制细胞增殖。细胞凋亡实验显示，RP11-169D4.1-001组细胞凋亡率高于LV5-NC组（P＜0.05），见图6。

图5 转染不同慢病毒载体喉鳞状细胞癌（LSCC）细胞各期细胞占比比较（与 LV5-NC 组比较，**P＜0.01，***P＜0.001）

图6 转染不同慢病毒载体喉鳞状细胞癌（LSCC）细胞凋亡率比较（与 LV5-NC 组比较，**P＜0.01，***P＜0.001）

2.4 转染不同慢病毒载体LSCC细胞迁移能力比较 划痕实验显示，两株细胞株中RP11-169D4.1-001组细胞迁移率均低于LV5-NC组（P＜0.05），见图7。Transwell实验得出了与划痕实验一致的结论。与LV5-NC组相比，RP11-169D4.1-001组细胞迁移到下室的细胞数量显著减少（P＜0.05），见图 8（插页）、9。

图7 划痕实验检测转染不同慢病毒载体喉鳞状细胞癌（LSCC）细胞迁移能力[a：细胞划痕图片（×40）；b：细胞迁移率比较；与LV5-NC组比较，**P＜0.01，***P＜0.001]

图8 Transwell实验检测转染不同慢病毒载体喉鳞状细胞癌（LSCC）细胞穿越Transwell小室后图片（0.1%结晶紫染色，×100）

图9 Transwell实验检测转染不同慢病毒载体喉鳞状细胞癌（LSCC）细胞每视野下细胞数比较（与LV5-NC组比较，***P＜0.001）

3 讨论

lncRNA是长度超过200 bp的非编码RNA，具有差异性表达的特性，在疾病发生、发展中发挥着重要作用。lncRNA具有多种生物学功能，如调控基因的表达、核组织和核区隔化、细胞核-质运输等[10]。然而，目前尚不清楚lncRNA表达的变化是疾病发生的原因还是结果。其中，基因间长链非编码RNA（long intergenic noncoding RNA,lincRNA）是一种位于基因间区域的lncRNA，它可以参与调控肿瘤的发生[12-13]。lincRNA HOTAIR（Homeobox transcript antisense RNA）、lincRNA-p21等已被鉴定为肿瘤发生和进展中的启动子或抑制子。例如，lincRNA HOTAIR在多种肿瘤中均显著过表达[14-15]。Gupta等[14]发现HOTAIR在原发性乳腺恶性肿瘤和转移肿瘤组织中表达上调，通过与多梳抑制复合体2相互作用增加了肿瘤的侵袭性和转移性。Li等[16]研究发现HOTAIR在LSCC中的表达水平明显高于相应的邻近非肿瘤组织，提示HOTAIR在LSCC中的致癌作用与促进人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN）甲基化有关。

RP11-169D4.1-001又名linc01537-201，长度为2450 nt。在之前的研究中，笔者团队构建了完整的喉癌lncRNA芯片数据库，芯片结果显示RP11-169D4.1-001在喉癌组织中表达上调。然而，通过扩大样本量发现，在87对配对的LSCC样本中RP11-169D4.1-001水平显著下调（66/87）。此外，通过临床相关因素分析结果表明，喉癌中RP11-169D4.1-001表达水平的降低与喉癌患者的颈部淋巴结转移和生存时间显著相关[9]。提示RP11-169D4.1-001可能在LSCC的发生、发展中发挥抑制作用。

为了研究RP11-169D4.1-001是否在LSCC中发挥作用，本研究利用RP11-169D4.1-001慢病毒颗粒上调了RP11-169D4.1-001在LSCC细胞中的表达水平。用嘌呤霉素和绿色荧光蛋白筛选稳定表达的细胞株，并通过qRT-PCR分析验证RP11-169D4.1-001的上调效果。然后本研究采用实时细胞分析、细胞克隆形成实验进一步验证RP11-169D4.1-001的细胞生物学功能。结果显示高表达RP11-169D4.1-001可以抑制细胞增殖的能力和克隆形成能力。此外，流式细胞周期检测结果显示，高表达RP11-169D4.1-001将细胞周期阻滞于G0/G1期，从而抑制细胞进入S期。流式细胞凋亡检测结果显示，RP11-169D4.1-001组细胞凋亡率明显高于LV5-NC组，表明RP11-169D4.1-001可促进LSCC细胞凋亡。此外，本研究发现了RP11-169D4.1-001在LSCC迁移中的作用。通过划痕实验和Transwell迁移实验显示，高表达RP11-169D4.1-001显著抑制了LSCC细胞的迁移能力。

综上所述，RP11-169D4.1-001在LSCC细胞增殖、凋亡、迁移等生物学行为中发挥抑癌作用，有望成为喉癌治疗的分子靶标，但其具体发挥作用的机制还有待进一步研究。