铁死亡在急性肾损伤中的作用机制

周桃桃 综述 郭兆安 审校

急性肾损伤(AKI)的诊断时间和死亡率之间存在相关性,血清肌酐是临床诊断AKI的常用指标,它对肾功能的急性变化不敏感。已知AKI的发病涉及细胞凋亡、坏死、自噬等多种病理过程。最新研究发现,AKI发病率及死亡率与铁死亡(ferroptosis)相关信号分子的表达呈正相关,且小分子铁死亡抑制剂和铁螯合剂能治疗AKI。铁死亡是由细胞内脂质过氧化代谢障碍引发的一种调节性细胞死亡,细胞内微环境受谷胱甘肽(GSH)过氧化物酶4 (GPX4)控制,并可被铁螯合剂和亲脂抗氧化剂抑制。铁死亡参与AKI的发生发展,抑制铁死亡可成为AKI治疗的新措施。因此,系统研究铁死亡在AKI的作用机制,对AKI的预防和治疗尤为重要。

铁死亡的发生机制

铁死亡是铁依赖的可调控性、非凋亡细胞死亡,由特定的小分子如Erastin和RAS-selective lethal 3 (RSL3)诱导。AKI过程涉及铁死亡、凋亡、坏死性凋亡、细胞焦亡等多种死亡形式。铁死亡是GSH/GPX4通路、脂质过氧化物积聚、铁离子依赖等引起的细胞膜氧化损伤;凋亡是由外源性死亡受体肿瘤坏死因子α途径、内源性(线粒体)途径和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)通路等介导的程序性死亡;坏死性凋亡是蛋白激酶3、混合谱系激酶结构域样蛋白激活,经死亡受体介导的凋亡失效后的程序性死亡;细胞焦亡是在脂多糖等的刺激下,炎性小体激活细胞因子,调节Caspase-1/Caspase-11等介导的细胞死亡[1]。铁死亡不具有肿胀细胞质、细胞器或细胞膜破裂等典型坏死的形态学特征,也不具有细胞收缩、染色质凝聚、凋亡小体的形成和细胞骨架解体等细胞凋亡的特征,而表现为细胞线粒体变小、膜密度增高和嵴减少,细胞成分上脂质过氧化增加、活性氧增多。在缺血再灌注损伤(IRI)导致的AKI中,缺氧可导致细胞凋亡和坏死,再灌注诱导铁死亡,表现为肾小管上皮细胞中出现明显的线粒体变小、膜密度增加。另外,IRI引起细胞焦亡并激活Caspase-3从而导致肾脏微血管稀疏[2]。叶酸(FA)诱导的AKI模型包含了临床AKI的所有病理表现,铁死亡在此类AKI中至关重要,铁死亡可促进炎症,所以铁死亡可能是其他形式的细胞死亡的驱动因素。在横纹肌溶解引起的AKI中铁死亡也占主导地位[3]。目前,Caspase激活和自噬溶酶体形成分别是凋亡和自噬的特异性标志,铁死亡虽没有特异性标志,但在各种AKI模型中,酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)使肾上腺素酸最早在非致死性铁死亡中上调,表明该分子是检测铁死亡的一个可靠的生物标志物。这些不同类型的细胞死亡是否能整合到一个完整的调控网络中还需要进一步探索。铁死亡的信号通路和关键调节因子见图1[4]。

图1 铁死亡的主要信号通路和关键调节因子

铁代谢铁在循环中以三价铁(Fe3+)与转铁蛋白结合的形式存在。Fe3+经膜蛋白转铁蛋白受体1、二价金属转运蛋白1转化为Fe2+释放到细胞质中不稳定铁池(LIP)中。过量的铁储存在铁蛋白中,铁蛋白重链(FTH)具有铁氧化酶活性,可催化Fe2+转化为Fe3+,使铁安全地并入铁蛋白壳以减少游离铁。过氧化氢与Fe2+反应,产生具有强氧化性的羟基自由基,该反应为芬顿(Fenton)反应。铁含量过载引起线粒体氧化磷酸化途径异常,产生ATP的同时产生大量的活性氧(ROS),氧化细胞及细胞器膜上多不饱和脂肪酸(PUFA),形成脂质过氧化物,直接或间接地破坏细胞结构和功能。在IRI导致的AKI中,再灌注期间,ROS产生增加,诱导肾小管上皮细胞铁死亡。在AKI中,血浆催化铁浓度显著增加,并与顺铂、缺血再灌注、氨基糖苷类、横纹肌溶解和血红蛋白尿等因素引起的广泛损伤相关,较高的血浆催化铁水平和较低的铁调素浓度均与AKI患者死亡率增加相关[5]。

氨基酸代谢谷氨酸-胱氮酸反向转运体(Xc-)系统以1∶1的比例交换细胞内外的谷氨酸和胱氨酸,细胞内胱氨酸还原为半胱氨酸。甲硫氨基酸在酶作用下生成S腺苷甲硫氨酸,去甲基和去腺苷后也生成半胱氨酸。半胱氨酸结合谷氨酸和甘氨酸形成GSH,GSH是细胞内抗氧化剂,用于细胞内的酶和非酶抗氧化反应,维持过氧化氢水平在生理范围内。GPX4是一种GSH依赖酶,活性中心是由含有硒代半胱氨酸的硒蛋白组成,通过利用GSH和含硫醇化合物,将脂质过氧化氢(L-OOH)还原为相应无害的醇(L-OH),从而抑制脂氧合酶(LOX)活性和磷脂/心磷脂氧化事件的发生,减少过氧化物的堆积。甲羟戊酸以乙酰辅酶A(CoA)为原料合成异戊二酸焦磷酸酯(IPP),IPP是硒代半胱氨酸tRNA成熟和合成具有活性的GPX4必不可少的信号[6]。Erastin、柳氮磺胺吡啶可抑制Xc-功能,使胱氨酸摄取不足,胞内抗氧化能力下降,脂质积累从而诱导细胞铁死亡。GPX4基因敲除小鼠AKI的发病率和死亡率显著增加,在IRI时,肾组织中GSH水平明显降低、GPX4活性降低、铁积累和脂质过氧化增加、铁敏感相关蛋白和基因表达上调[7]。

脂质代谢PUFA含有花生四烯酸(AA)或其衍生物肾上腺素酸(AdA),磷酸戊糖途径可直接将葡萄糖氧化脱氢和脱羧,产生NADPH作为还原剂参与脂肪酸的合成。AA和ACSL4酯化为磷脂酰乙醇胺(PE),再由LOX通过与重组人磷脂酰乙醇胺结合蛋白1联结形成复合体15-LOX/磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(PEBP1),发生变构调节提供促进铁死亡的信号sn2-15-HpETE-PE位点,最终氧化为磷脂氢过氧化物(PE-AA/AdA-OOH)和ROS,其中15-LO2 在肾小管上皮细胞高表达,15-LO1和15-LO2均参与缺血性急性肾损伤[8]。ROS通过Fenton反应生成具有破坏性的羟基自由基,与邻近分子发生急速反应,或与细胞脂质成分过氧化生成大量脂质自由基,导致含有丰富PUFA的细胞膜、质膜变薄,结构和功能被不可逆性破坏。核因子E2相关因子2(Nrf2)被认为是抗氧化系统的重要调节因子,其下游靶基因参与维持氧化还原稳态,如GSH合成酶,GPX4,氧化应激传感器分子kelch样ECH关联蛋白1(KEAP1)通过泛素化降低Nrf2活性,在AKI时,甲基巴多索隆通过抑制KEAP1的泛素活性来激活Nrf2,使肾小球滤过率得到改善[9]。在FA-AKI中发现肾脏脂质过氧化,经铁他汀-1预处理的小鼠可以改善肾功能,减少组织损伤。

铁死亡参与的病理生理过程

炎症反应在细胞应激过程中,PUFAs在酶作用下分离出AA,AA可通过环氧合酶(COX)、LOXs和CYP450酶三条代谢途径参与炎症反应,进一步加重铁死亡,AA经COX代谢生成前列腺素(PGs)和血栓素促进炎症反应。COX2是一种由前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)编码的诱导酶,可激活巨噬细胞或其他炎症细胞。相反,铁死亡上调PTGS2表达,加速AA代谢,促进炎症信号分子的分泌[10]。AA经LOXs代谢生成白三烯,趋化和聚集白细胞和单核细胞,诱导巨噬细胞释放超氧阴离子和过氧化氢,以及促进PGs分泌和各种氧自由基产生。COXs和LOXs的活性最终受到细胞脂质过氧化物稳态水平的直接控制,GPX4通过降低细胞内氧化还原状态直接抑制这些酶的激活[11]。在草酸盐结晶和GPX4缺失诱导的AKI中,巨噬细胞激活、肿瘤坏死因子α和单核细胞趋化蛋白等促炎因子表达上调,且该炎症反应受LOXs和PGs等脂代谢相关基因的调节,也可被铁抑制素1(Fer-1)抑制,另外,叶酸、他莫昔芬诱导的AKI小鼠模型中,均有铁死亡相关的坏死性炎症的发生[12-13]。

自噬在饥饿或氧化应激等条件下,GSH的减少常伴有自噬发生,脂质过氧化物也可促进自噬体的形成,而GPX4过表达能抑制ROS介导的自噬反应。铁自噬是一种由核受体共激活因子4(NCOA4)将铁蛋白募集到自噬体中进行溶酶体降解和释放游离铁的过程,下调NCOA4可以抑制Erastin诱导的铁死亡。脂肪自噬释放游离脂肪酸,促进细胞氧化,而脂滴水平与氧化应激诱导的铁死亡呈负相关,RAB7A基因在脂质吞噬过程中介导多泡体和溶酶体对脂滴的募集,RAB7A表达增加会促进脂滴降解,增加铁死亡的发生[14]。研究证实了与自噬密切相关的信号通路相关分子GPX4、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、Nrf2、p53和ACSL4等参与了铁死亡,在应用铁死亡诱导剂后,自噬体累积,介导自噬的分子参与铁死亡的发生,如RAB7A促进脂吞噬、BECN1抑制Xc-系统、STAT3诱导溶酶体膜通透性增加[15]。在FA-AKI中,铁死亡和自噬相关分子GPX4、SLC7A11、FTH1相应mRNA和蛋白的表达明显降低[16]。

内质网应激内质网包含一半以上的脂质双层,是多数细胞器中膜的脂质来源,也可能是铁死亡发生的关键部位。在应激条件下,可引起内质网应激(ERS)。铁死亡与ERS密切相关,在铁死亡中观察到ERS标记物如阳离子转运调控样蛋白1、激活转录因子4(ATF4)和真核启动因子(eIF)2α磷酸化的上调,其中ATF4还参与内质网中分子伴侣蛋白热休克70 kD蛋白5(HSPA5)的上调,减少GPX4降解而抑制铁死亡中的脂质过氧化[16]。Erastin诱导的AKI通过刺激细胞的铁死亡加重ERS,青蒿琥酯可以通过PERK-eIF2A-ATF4-CHOP途径诱导ERS发生并增加p53调控因子的表达,诱导铁死亡[17-18]。

铁死亡与AKI

铁死亡在AKI的发生发展中起重要作用。了解铁死亡的发病机制,可针对AKI中铁死亡的不同靶点选择治疗药物(表1)[19]。其中,Fer-1、HO-1对肾脏的保护作用在多种AKI动物模型中均已得到证实[20-21]。抑制铁死亡和铁调素给药已成为预防和治疗AKI的新策略。

表1 铁死亡抑制剂[19]

在FA-AKI中发现肾脏细胞铁死亡主要由Nrf2/GPX4信号通路调节[22]。另外,铁死亡具有免疫原性和促炎性,在FA-AKI中触发炎症反应,IL-33是坏死细胞释放的警告因子,介导肾损伤,Fer-1可减少AKI相关的肾脏炎症[23]。罗沙司他是缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶的抑制剂,对FA-AKI的保护作用是通过蛋白激酶B(PKB)/糖原合成激酶3β(GSK-3β)通路激活Nrf2,其预处理的与未处理的小鼠相比,肾功能改善,铁积累和脂质过氧化受抑制,抗氧化酶和GSH水平升高[24]。顺铂诱导的AKI的铁死亡过程受肌醇加氧酶(MIOX)的影响,MIOX的过表达除了通过铁蛋白吞噬和脂质过氧化促进铁沉积外,还可能通过下调GPX4活性和细胞内GSH浓度来抑制“铁沉积终止系统”,帕立骨化醇降低脂质过氧化、4-羟基壬烯醛和丙二醛,在功能和组织学上减轻顺铂诱导的AKI[25-26]。IRI诱导miR-182-5p和miR378a-3p上调,进一步下调GPX4和SLC7A11,诱导AKI中的铁死亡[27],肝再生增强因子(ALR)可调控Xc-系统和清除ROS,并在胰岛素抵抗导致的AKI中起治疗作用[28]。Panx1参与铁和ROS代谢基因NCOA4、Nrf2、HO-1和FTH1在铁死亡中的表达,其缺失激活有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)通路抑制NCOA4介导的铁吞噬和增加抗氧化基因HO-1的表达以保护肾脏免受IRI[29]。横纹肌溶解诱导的AKI中,肾内肌红蛋白代谢产生的Fe2+通过Fenton反应诱导铁死亡,研究发现,FTH敲除小鼠比野生型小鼠肾损伤严重,表明重链铁蛋白对肾小管的保护作用及铁离子在AKI中的重要性[30]。重症急性胰腺炎大鼠肾组织中铁积累和脂质过氧化增加,这些变化伴随着GPX4活性的降低、铁死亡相关蛋白和基因的上调,证明铁死亡与重症急性胰腺炎诱导的AKI有关,脂肪酶1可抑制铁死亡减轻肾损伤并改善肾功能[31]。

小结:部分重症AKI患者早期应用肾脏替代治疗并不能获益[32]，对铁死亡的深入研究有助于充分认识该疾病的发病机制并提供治疗新思路。以铁死亡作为靶点治疗AKI,可能有良好的应用前景。然而目前针对铁死亡的研究仍存在一些问题,如铁死亡在组织内环境稳定、神经网络形成和维持、免疫和衰老中的生理作用有待充分研究。另外,细胞内脂质过氧化与内质网、线粒体、溶酶体有关,然而其在细胞器的精确作用及其发生顺序不明确。就药物治疗方面,药物多在急性疾病模型中显示出疗效,然而长期疗效未知,未来需精心设计临床试验,以将动物AKI模型的发现扩展到人类。