玉米ZmCCT基因缺失区段原核表达载体的构建与蛋白表达

徐 阳，崔丽娥，赵新玉，张兆恒，王 丽，宋亚申，王维香

(北京农学院植物科学技术学院，北京102206)

玉米(ZeaMaysL.)是全球普遍种植的粮、饲兼用的重要作物[1-2]。玉米茎腐病是一种真菌性玉米病害，严重危害世界各玉米产区的生产[1]。玉米茎腐病一般在玉米生长过程中的乳熟期达到发病高峰，而此时正是玉米形成果穗的关键时期。玉米茎腐病危害严重，且进一步呈上升趋势，发病率一般为15%～20%，严重时可高达80%，玉米产量损失最高可达20%[3-7]。玉米茎腐病病情的逐年加重已成为玉米生产中亟待解决的问题并成为限制玉米生产的重要因素之一[8]。发掘更好的抗性种质资源、克隆和鉴定新的抗性基因和深入探究玉米响应病原物侵染的分子作用机理，将会为种质资源创新和培育抗性品种提供理论基础。

早期研究表明，植物数量抗性位点(Quantitative Resistance Loci，QRL)对病原菌表现出部分抗性，这种抗性通常能够持久保持，对抗的病原菌种类多，且具有广谱性[9]。近年来，随着模式作物序列的公布和分子生物学技术的发展，作物中抗病QTL的克隆取得很大研究进展，大量的QTL位点被克隆[10]。涉及到这些QTL位点的抗病基因仅成功克隆6个：Lr34[11]、Yr36[12]、Pi21[13]、Rcg1[14-15]、ZmWAK[16]和ZmCCT[17]，而且有关这些QTL位点的抗病基因分子作用机制缺乏报道。这些QTL抗病基因中，Pi21基因是一个对水稻稻瘟病具有广谱抗性的QTL，表现出非小种特异的抗性[13]。FUKUOKA等[18]利用近等基因系材料定位并克隆Pi21基因。Pi21编码一个富含脯氨酸的蛋白，该蛋白包含一个重金属结合功能域和一个蛋白与蛋白互作功能域。小麦中，通过图位克隆方法获得的Lr34编码一个类似ABC transporter的蛋白，对小麦叶锈病、小麦条锈病和小麦白粉病均有抗性[11,19]。抗病基因Yr36控制着高温条件下对小麦条锈病的广谱抗性[12]。FU等[12]利用感病亲本Langdon与遗传背景相近的重组代换系杂交的分离群体对Yr36进行精细定位，并在此基础上克隆Yr36，该基因编码一个包含激酶功能域和START磷脂结合功能域的蛋白，这两个结构域对小麦条锈病的抗病性具有重要作用。

钟涛[20]和TAO等[21]采用连续精细定位方法，在玉米重组个体后代测定中精细定位一系列抗病QTL，如：抗粗缩病的qMrdd1、抗丝黑穗病的qHSR1、抗灰斑病的qRgls1和qRgls2，并克隆抗茎腐病和抗丝黑穗病的QTL。左为亮[22]利用重组个体后代测定的QTL连续精细定位和克隆检测到一个抗丝黑穗病主效QTL，并通过转基因功能互补鉴定证明该主效抗病QTL为ZmWAK基因。该基因编码细胞壁相关激酶，在围绕韧皮部的薄壁细胞中高表达，能够激活水杨酸依赖的抗病响应基因，抑制病原菌的生长，从而达到最佳的抗病效果。

针对玉米禾谷镰刀菌[23]、肿囊腐霉菌[24]、赤霉菌[25]等病原菌茎腐病，已经鉴定到一些QTLs，但由于研究采用的手段和群体有所差异，使得QTLs具有不同的遗传特性[20]。SONG等[24]在抗腐霉茎腐病自交系齐319中定位并克隆抗肿囊腐霉菌茎腐病基因RpiQI319-1和RpiQI319-2。DUAN等[26]在抗病材料X178中将抗肿囊腐霉菌茎腐病显性基因RpiX178-1精确定位到1号染色体分子标记SSRZ8和IDP2347之间。MA等[25]在抗病自交系H127R材料中将抗赤霉菌茎腐病QTL-qRfg3定位到3号染色体，物理距离精确到350 kb。

研究报道，Pè等[23]利用高抗茎腐病玉米自交系B87和高感茎腐病自交系33-16组配150个F2:3家系。接种禾谷镰刀菌后对性状进行鉴定和分析，定位到5个抗禾谷镰刀菌茎腐病的QTL位点，分别位于第1号、第3号、第4号、第5号和第10号染色体上。JUNG等[27]将玉米抗炭疽茎腐病的主效QTL(Rcg1)定位到第4号染色体长臂上。WOLTERS等[15]克隆抗炭疽茎腐病的主效QTL-Rcg1。Rcg1是玉米抗炭疽茎腐病的一个主效QTL基因。该基因编码一个典型的NBS-LRR类抗病基因蛋白，这一家族蛋白在病原菌识别、植物抗病反应过程中起重要作用[28-29]。YANG等[30]认为玉米对肿囊腐霉菌茎腐病的抗性受单基因Rpi1控制，并将其定位在第4号染色体分子标记bnlg1937和agrr286之间，遗传距离为5.7cM。董五辈和王国英[31]利用高抗茎腐病自交系P138和高感茎腐病自交系5003组配F2:3家系，通过接种肿囊腐霉菌鉴定表型，同时检测基因型，将抗病基因定位在第4号染色体分子标记bnlg490和umc1382之间，遗传距离为4.1cM。

前期研究中，YANG等[30]将一个抗禾谷镰刀菌茎腐病的单基因定位在第6号染色体分子标记mmc0241和bnl3.03之间，遗传距离为5.0cM，他们将另一个抗禾谷镰刀菌茎腐病主效QTL-qRfg1定位到bin10.04染色体500 kb区段内，可使抗性提高37.2%～54.4%[9,15,20]。他们将主效QTL-qRfg1位置缩短到170 kb范围内，通过高密度遗传图谱分析和转基因植物抗性鉴定等手段克隆到玉米抗茎腐病数量抗病基因ZmCCT。在ZmCCT转基因T2代、T4代和T6代中，阳性植株田间抗性平均提高30%，具有明显的抗茎腐病功能。他们利用以1145和Y331构建的回交群体(Y331为轮回亲本)，对位于2号染色体上bin10.04位置的主效QTL-qRfg1进行精细定位。利用4 035株BC6F1群体(来自41个BC5F1交换单株)将qRfg1定位到约190 kb的区间内。此后，利用新开发的标记CCT11和SSR483在4 035株BC6F1群体中进一步筛选重组个体，找到位于定位区段内的2个新的重组类型，将qRfg1区段缩小到分子标记CCT11和SNP551之间，物理距离约为170 kb。通过多分子标记筛选BAC文库，通过测序，序列比较和功能注释，确定ZmCCT为QTL-qRfg1的候选基因，并克隆到抗禾谷镰刀菌茎腐病基因ZmCCT[32]。

目前，有关玉米抗茎腐病基因ZmCCT的抗病作用机理尚不明确。已知ZmCCT基因编码一个转录因子，定位于细胞核并含有保守的CCT功能域[9]。ZmCCT中含有的CCT保守域在玉米抗茎腐病过程中起重要作用。CCT结构域为植物所特有，CCT家族的基因是参与植物抗逆过程的重要基因。CCT结构域最早在拟南芥中被发现，其C端是由约43～45个氨基酸组成的结构域，该段氨基酸序列在CONSTANS，CONSTANS类基因和TIMING OF CAB1(TOC1)表现为高度保守，因此，它被命名为CCT结构域[33-35]。ZmCCT作为一个典型的CCT结构域因子，究竟如何响应抗病逆境信号，如何在转录水平上调控下游靶标基因来实现其生物学功能尚不清楚。进一步鉴定CCT保守结构域的功能，探究ZmCCT基因编码产物参与抗病的分子机理，有助于全面解析ZmCCT基因的作用机制。本研究将进一步探究抗玉米茎腐病基因ZmCCT的功能，对ZmCCT基因的缺失区段进行载体构建及原核蛋白表达并在大肠杆菌中表达纯化，为后续ZmCCT蛋白免疫抗体的制备和分子机理等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

玉米近等基因系Y331-△TE1是携带不含转座子的抗病ZmCCT等位基因，玉米近等基因系Y331是携带含转座子的感病ZmCCT等位基因，见图1(Y331-△TE1和Y331来源于中国农业大学徐明良教授)。温室培养(28 ℃，光照16 h；24 ℃，黑暗8 h)，待生长到三叶一心时采集植株地上部分，并将样品液氮速冻，于-80 ℃保存备用。

pMD19-T载体和Rosetta(DE3)感受态细胞购自北京博迈德基因技术有限责任公司。PGEX-6P-1载体为北京农学院作物逆境生物学实验室保存。普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)和质粒小提试剂盒(DP103)购自天根生化科技(北京)有限公司。Prime Seript One-Step gDNA Removal、cDNA Synthesis SuperMix试剂盒、6×DNA loading buffer(G2525)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)溶液(I5005)和LAB2000 DNA Marker(L2000)均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1ZmCCT基因不同缺失区段的扩增与原核表达载体的构建 使用Trizol法提取玉米Y331-ΔTE1组织的总RNA，使用反转录试剂盒反转录，获得第一链cDNA，保存于-20 ℃，备用。

ZmCCT全长的正向引物为5′-TTGGATCCATGATGTCGTCGGGGCCAGCAGC-3′，反向引物为5′-TTCTCGAGTCATTCGGTTACCTTGGCAA-3′。根据NCBI网站GenBank上ZmCCT基因的序列(LOC103641424，图2)，使用DNAMAN软件设计4对克隆引物。4对克隆引物分别为ZmCCT1-300、ZmCCT300-540、ZmCCT540-717和ZmCCT1-540(表1)。以cDNA为模板分别用4对克隆引物进行扩增。

表1 引物序列Tab.1 DNA sequence for primer

对扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行检测。胶回收试剂盒回收目的片段。回收的DNA产物存放于-20 ℃，备用。

将回收DNA产物与pMD19-T(simple)载体进行连接。复苏感受态细胞BMTOP10加入T载体反应连接液，震荡培养1 h。将菌液接种到含氨苄西林抗性的LB固体培养基中，37 ℃过夜培养12～14 h。使用高纯度质粒小量提取试剂盒(柱离心型)进行质粒提取，得到含有目的片段的质粒DNA。用限制性内切酶(BamHI、XhoI)对提取的质粒进行双酶切验证阳性克隆。将阳性DNA片段亚克隆到原核表达载体PGEX-6P-1中，16 ℃过夜连接。将连接产物转化至TOP10感受态细胞中，37 ℃过夜培养。然后挑取单菌落并将其接种于LB液体培养基中(含100 g/mL的氨苄西林)过夜培养，菌落PCR验证阳性，送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。

1.2.2ZmCCT缺失区段原核表达载体的诱导表达与鉴定 将鉴定为克隆阳性的PGEX-6P-1-ZmCCT1-300、PGEX-6P-1-ZmCCT300-540、PGEX-6P-1-ZmCCT1-540和PGEX-6P-1-ZmCCT540-717质粒转化到Rosetta中，37 ℃过夜培养。挑取单株菌落。再接种于LB液体培养基(100 μg/mL的氨苄西林)中，过夜振荡培养。转接到3 mL LB液体培养基(100 μg/mL的氨苄西林)中，37 ℃振荡培养约1 h。菌液OD600值为0.6时，加入0.4 mmol/L的IPTG，16 ℃培养诱导3 h，离心，弃上清，收集沉淀，沉淀使用1×PBS重悬，并加入1×loading buffer，100 ℃金属浴加热12 min，使蛋白变性。经高温变性后的样品4 ℃、12 000 r/min离心3 min。将诱导菌株PGEX-6P-1-ZmCCT和未诱导的阴性对照，进行SDS-PAGE电泳检测，对重组菌表达及可溶性情况进行初步鉴定。

分别挑选2个生长较好的单株菌落，接种至2 mL LB液体培养基(100 μg/mL的氨苄西林)中，于摇床(37 ℃，220 r/min)中培养12～14 h；将400 μL培养液接种于带有氨苄西林的LB液体培养基内(每组2管)，摇床37 ℃，220 r/min培养至OD600值为0.6。选取一组加入6 μL终浓度为0.4 mmol/L诱导剂IPTG。另一组不加诱导剂IPTG作为阴性对照，摇床37 ℃，220 r/min培养3 h。将1.5 mL培养液加入离心管内，12 000 r/min离心3 min收集沉淀；在1.5 mL培养液的沉淀中加入15 μL的10×loading buffer和20 μL的ddH2O混匀，100 ℃变性处理使其充分混合，重悬后取8 μL重悬液上样进行SDS-PAGE电泳(120 V恒压，1.5 h)；使用考马斯亮蓝染色1 h，脱色后鉴定。

1.2.3 PGEX-6P-1-ZmCCT表达产物的纯化 在0.01～5.00 mmol/L的范围内改变诱导剂IPTG浓度，在诱导的不同时间测定OD600值。依据SDS-PAGE分析，确定终浓度为0.4 mmol/L的诱导剂IPTG，过夜培养8 h为最佳诱导表达条件。吸取12～14 mL菌液至1 000 mL LB液体培养基中，培养至OD600值为0.6。加入诱导剂IPTG诱导表达，过夜培养8 h。离心，收集沉淀，加入裂解缓冲液充分悬浮菌体沉淀。超声处理破碎细胞后离心(4 ℃ 12 000 r/min，15 min)，取上清，并吸取1 mL作为对照。用裂解缓冲液平衡镍柱约30 mL，加入40 μL载体标签对应的亲和层析珠，充分结合4 h。洗脱收集蛋白纯化液体，通过SDS-PAGE电泳检测，观察纯化结果。

2 结果与分析

2.1 ZmCCT1-300、ZmCCT300-540、ZmCCT540-717和ZmCCT1-540 片段的构建

ZmCCT中约582～714 bp位置含有一个保守CCT结构域。将ZmCCT基因分为3个缺失区段，然后构建4个缺失突变体ZmCCT1-300、ZmCCT300-540、ZmCCT1-540和ZmCCT540-717，见图3。

2.2 ZmCCT1-300、ZmCCT300-540、ZmCCT540-717和ZmCCT1-540 缺失区段PCR产物片段的获得

PCR扩增得到ZmCCT基因的缺失区段。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，ZmCCT1-300、ZmCT300-540、ZmCCT540-717和ZmCCT1-540分别在约300、240、177和540 bp处呈现特异性条带，且与预期的条带大小吻合，见图4。

2.3 pMD19-T载体重组质粒的鉴定

将ZmCCT片段插入pMD19-T载体并转化至感受态细胞TOP10中，过夜培养单克隆菌落并提取重组质粒，双酶切鉴定后进行凝胶电泳分析，在预期位置出现大小合适的目的片段(图5，图中杂带为引物非特异性扩增)，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化回收。

2.4 PGEX-6P-1载体重组质粒的双酶切与测序鉴定

连接pMD19-T载体回收后的片段插入到PGEX-6P-1表达载体后，经双酶切鉴定和测序鉴定，在预期位置出现大小合适的DNA目的条带(图6，图中杂带为引物非特异性扩增)。同时，将条带正确的克隆进行DNA测序，发现DNA序列完全正确，未出现点突变。

2.5 ZmCCT 基因在原核表达载体中的表达及可溶性分析

将PGEX-6P-1-ZmCCT重组质粒转化至Rosetta(DE3)宿主菌，挑取菌落进行蛋白诱导表达小量检测，当加入诱导剂IPTG诱导表达时，ZmCCT1-300、ZmCCT300-540、ZmCCT540-717和ZmCCT1-540均有明显蛋白富集，而未诱导宿主菌未见明显表达(图7)。将已经表达的菌液按照菌液∶甘油=3∶2的比例保存于-80 ℃，用于蛋白纯化。

2.6 ZmCCT 基因表达蛋白的纯化

亲和层析纯化重组蛋白，将超声前的上清、不同批次的洗脱液、结合后的流穿液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。流经镍柱后，重组蛋白均结合到表达载体对应标签的亲和层析珠上，洗脱后获得大小相符的目的条带，尽管有杂带出现，但在对应大小处有大量蛋白富集。成功获得ZmCCT1-300、ZmCCT300-540和ZmCCT1-540三段表达符合预期的蛋白(图8)。

3 讨 论

玉米茎腐病发病常导致玉米茎秆变黄直至枯萎，是严重危害玉米生产的土传真菌病害。近年来，随着模式作物序列的公布和分子生物学技术的发展，尽管作物中抗病QTL的克隆取得很大进展，但是，由于植物数量抗病基因的复杂性，迄今为止，仅有为数不多的QTL抗病基因被克隆到。ZmCCT基因作为目前仅有的抗禾谷镰刀菌茎腐病基因被克隆，WANG等[32]和KU等[33]研究ZmCCT基因一个近130 kb的QTL序列区段上编码一个假基因、一个CCT结构域转录因子和两个转座因子，转座子TE1的插入导致ZmCCT功能发生变化，当TE1插入时，玉米抗禾谷镰刀菌的抗性减弱。

CCT结构域为植物所特有，在编码开花相关基因的蛋白中被发现，是典型的一因多效基因，参与植物调控光周期开花、光信号传导、昼夜节律调节和植物生长等过程[34]。CONSTANS蛋白中包含两个高度相似的B-Box结构域，B-Box结构域中有7个保守的残基使得CCT结构域高度保守[35]。在本研究中，ZmCCT1-300、ZmCCT300-540和ZmCCT1-540三个缺失区段在对应蛋白大小处出现明显的条带，经镍柱纯化后，获得高纯度的重组融合蛋白。CCT结构域大约位于ZmCCT基因的580 bp到714 bp的位置上，虽然成功构建仅包含CCT结构域的蛋白表达载体，但是未成功纯化出原核蛋白。可能是由于CCT的特殊结构导致的，CCT结构域编码的蛋白属于锌指蛋白超家族，锌指蛋白的三维结构十分复杂，这可能是ZmCCT540-717未成功纯化的原因之一[27]。还有可能是ZmCCT540-717没有进行原核蛋白表达，后期准备尝试用真核表达载体进行纯化ZmCCT540-717区段蛋白。

此外，ZmCCT不仅在抗玉米禾谷镰刀菌抗性中起到非常重要的作用，同时还受到光周期的调节从而影响玉米的花期[18]。ZmCCT所在的位置是许多重要农艺性状QTL定位的热点位置，可能是其他逆境胁迫响应的热点。ZmCCT启动子中TE1转座子也是降低光周期敏感性的突变位点。ZmCCT究竟如何参与逆境胁迫的信号响应？以及ZmCCT如何作为转录因子协同其他互作蛋白去调控下游的靶标基因？这些问题有待于进一步研究。该研究为进一步探究ZmCCT的功能，后续免疫蛋白抗体的制备以及下游靶标基因的寻找等分子机理奠定基础。