95例住院患儿耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分离株的分子流行病学特征及药物敏感性

陈虹宇，祖莹，罗庆礼，罗小娟，王丹，李德发

(1. 广东省深圳市儿童医院检验科，广东 深圳 518026；2. 广东省深圳市儿童医院伦理委员会办公室，广东 深圳 518026；3. 安徽病原生物学省级实验室和人兽共患病安徽省重点实验室，安徽 合肥 230032；4. 广东省深圳市儿童医院党办，广东 深圳 518026；5. 广东省深圳市儿童医院院办，广东 深圳 518026)

金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus，SA)广泛分布于自然界，也常定植在人和动物的皮肤及与外界相通腔道中。研究表明[1]，有25%～30%的健康人群鼻前庭有SA定植。细菌在与宿主共进化的数百万年间，不断地修饰和调整对宿主的黏附、侵袭和致病机制，以适应宿主的防御系统。青霉素应用于临床以前，SA感染死亡率为80%。20世纪40年代，青霉素应用临床不久就发现了耐药的菌株，其后20年左右，80%以上的SA菌株对青霉素耐药。随着耐酶青霉素-甲氧西林上市，Jevons于1960年10月又分离到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)菌株。MRSA可以引起多种感染性疾病，包括皮肤软组织感染、菌血症、坏死性肺炎、感染性心内膜炎和毒素休克综合征等。MRSA的出现和传播已经成为全球关注的焦点，特别是2002年美国报道了耐万古霉素的SA(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus，VRSA)之后。过去的几十年里，人类与细菌之间的“斗争”从未停止过。任何控制MRSA流行和传播的策略，都要建立在对MRSA克隆性质和数量的正确认识上。近年来，分子生物学技术突飞猛进，对MRSA基因水平的研究更加深入细致，MRSA的流行状况及其起源进化得到初步阐明。本研究就是利用分子生物学手段对95例住院患儿的MRSA分离株进行分子分型和序列分析，明确本地区MRSA的优势菌株，并根据药物敏感性实验分析MRSA菌株的耐药信息，为临床防控和治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集临床科室送检的各类标本，经常规细菌培养和鉴定分离出327株金黄色葡萄球菌，其中MRSA 95株(痰标本64例、脓液及伤口分泌物24例、血培养标本3例、关节腔穿刺液2例、脑脊液1例、尿液标本1例)。

1.2主要试剂和仪器 分离培养用的血平板为郑州安图生物工程股份有限公司产品，VITEK 2 COMPACT 全自动细菌培养鉴定仪及其配套的GP鉴定卡、GP-67药敏卡为法国生物梅里埃公司产品，鉴定质控菌株铅黄肠球菌ATCC 700327和药敏质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC 29213、粪肠球菌ATCC 29212由卫生部临检中心提供。细菌基因组DNA抽提试剂盒、PCR预混液及DNA Marker购自生工生物工程(上海)有限公司，琼脂糖购自西班牙GENE公司，PCR扩增引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。温度梯度基因扩增仪为德国MIONETRA公司产品，电泳仪和电泳槽为美国BIO-RAD公司产品，凝胶成像系统为江苏省捷达科技发展有限公司产品。

1.3方法

1.3.1细菌DNA提取 取1 ml菌液，用细菌基因组DNA抽提试剂盒，按照说明书提取样品DNA，于-20℃保存作为所有PCR模板备用。

1.3.2mecA基因扩增 扩增引物：上游5′-AGAGTAGCACTCGAATTAGGCAGT-3′；下游5′-AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC-3′；产物大小：404 bp。反应体系：细菌基因组DNA模板2.0 μl，上下游引物各1.0 μl，PCR Premix Taq 25 μl，总体积为50 μl。扩增条件：94℃预变性5 min，接着94℃变性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸60 s，共35个循环，最后72℃延伸10 min。

1.3.3SCCmec分型 SCCmec分型扩增的引物和反应条件参照文献[2]：PCR总反应体积为25 μl。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，65℃ 退火45 s，72℃延伸90 s，共10个循环；再94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，共25个循环；最后72℃延伸10 min。见表1。

表1 SCCmec分型引物序列

1.3.4MLST分型 使用PCR检测7个管家基因：arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqil。引物设计(见表2)参照参考文献[3]。扩增条件：94℃预变性5 min，然后94℃变性50 s，退火温度50℃时间30 s，72℃延伸50 s，共30个循环，最后72℃延伸10 min。扩增产物由生工生物工程(上海)有限公司进行测序。测序结果在MLST数据网站(http：//saureus.mlst.net)上比对等位基因的序列类型(sequencetype，ST)从而判定相应菌株的ST类型。应用eBURSTv3软件进行菌株亲缘关系分析。

表2 多位点序列分型引物序列

1.3.5spa分型 利用标准的spa基因分型方法[4]，参照文献[5]设计一对引物，上游引物：5′-TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC-3′；下游引物5′-CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-3′。PCR总反应体系为50 μl：包括Taq PCR Master MIX 25 μl、DNA模板1 μl、10 μM引物各2 μl、ddH2O 20 μl；PCR扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，53℃退火60 s，72℃延伸90 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min。

1.3.6药物敏感性分析 样本接种、分离培养严格按《全国临床检验操作规程》的标准流程[6]， VITEK 2 COMPACT 全自动细菌培养鉴定仪及其配套的GP鉴定卡、GP-67药敏卡按说明书进行菌种鉴定及药敏试验，药敏试验结果判读参照CLSI 标准[7]。

2 结果

2.1MRSA菌株的确认 细菌鉴定仪筛选出的95株MRSA菌株，经PCR检测mecA基因确认。95株细菌均出现大小为404bp的PCR扩增产物，说明mecA基因全部阳性。PCR扩增结果，见图1。

注：M： DNA Marker；1～14泳道：待证实金葡菌样品。图1 mecA基因PCR扩增结果图

2.2SCCmec分型结果 PCR扩增结果(见图2)显示，95株MRSA共有5种SCCmec基因型和3种亚型，其中SCCmecⅠ型1株，SCCmecⅡ型4株，SCCmecⅢ型17株，SCCmecⅣa型65株，SCCmecⅣb型2株，SCCmecⅣd型4株，SCCmecⅤ型2株。

注：M：DNA Marker；1～7分别是：SCCmecⅠ、SCCmecⅡ、SCCmecⅢ、SCCmecⅣa、SCCmecⅣb、SCCmecⅣd和SCCmecⅤ。

2.3MLST分型 7对管家基因扩增结果显示，95株MRSA由10种ST型组成，其中46株为ST59型，占48.42%；另外49株MRSA分别是ST45型13株，占13.68%；ST1型和ST338型各12株，分别占12.63%；ST72型和ST398型各3株，分别占3.16%；ST88型2株，占2.11%；ST25型、ST47型和ST630型各1株，分别占1.05%；还有1株未能分型。eBURSTv3软件分析表明，10种ST型属于6个克隆群(CC59、CC5、CC45、CC398、CC88和CC25)，其中CC59(ST59、ST338)占61.05%(58/95)，CC5(ST1、ST72、ST630)占16.84%(16/95)，CC45(ST45、ST47)占14.74%(14/95)。

2.4spa分型 95株MRSA共鉴定出19种spa类型，另有4株待确认，其中t437型51株、t114型9株、t116型8株，分别占53.68%、9.47%和8.42%，是主要的spa型；其他型别占28.42%，t441型3株，t034、t664、t5935各2株，t4549、t1784、t1764、t189、t011、t3736、t5132、t127、t324、t3527、t078、t6378、t693和t026各1株。综合SCCmec分型、MLST分型和spa分型三类分型结果，其中ST59-SCCmec Ⅳa-t437共有33株，约占34.74%，是最主要的流行克隆；其次是ST45-SCCmec Ⅳa-t116共有7株，约占7.37%。

2.5药物敏感试验结果 选用14种非β内酰胺类抗菌药物了解95株不同分子特征MRSA的耐药情况。药敏结果显示，所有菌株都对环丙沙星、庆大霉素、左氧氟沙星、利奈唑胺、莫西沙星、呋喃妥因、奎奴普汀、替加环素和万古霉素敏感，对克林霉素(82.10%)、红霉素(82.10%)、利福平(15.78%)、四环素(41.05%)和复方磺胺甲噁唑(3.15%)等抗菌药物分别有不同程度的耐药，多重耐药谱见表3。其中四种主要克隆MRSA的耐药情况是：ST59对克林霉素、红霉素和四环素的耐药率分别为89.13%、89.13%和60.87%；ST338对克林霉素、红霉素和四环素的耐药率分别为91.67%、91.67%和41.67%；ST1对克林霉素、红霉素和四环素的耐药率分别为75%、75%和33.33%；ST45对克林霉素、红霉素和利福平的耐药率分别为53.85%、53.85%和100%。

表3 不同分子特征MRSA菌株对14种非β内酰胺类抗菌药物的耐药情况

3 讨论

由于免疫力低，儿童是MRSA的主要易感人群，而且在感染类型和临床治疗等方面与成人都有较大差异。另外，不同地区不同医疗机构由于标本类型、收治病例以及用药习惯不同，MRSA的检出率和药物敏感性也有很大差别[8-9]。因此，监测和研究本地区儿童感染MRSA的分子流行病学特征以及药物耐药情况，对指导儿科临床合理用药、制定MRSA流行的防控措施、减少或延缓耐药株的产生有极其重要的临床意义。

MRSA主要是通过获得编码低亲和力青霉素结合蛋白2a(PBP2a)的mecA基因表现对甲氧西林耐药。mecA基因存在于金黄色葡萄球菌染色体盒(SCCmec)上，主要由mec基因的ccr基因复合体组成。依据mec操纵子类型和ccr型别以及J区的结构差异性，分为Ⅰ～Ⅺ共11种类型，人源性MRSA中常见的SCCmec类型有Ⅰ～Ⅴ型5种主要基因型和Ⅳa、Ⅳb和Ⅳc 3种亚型。根据来源，MRSA分为医院获得型MRSA(HA-MRSA)和社区获得型(CA-MRSA)。两者在菌株致病性、流行特征及耐药性方面差异明显，正确区分这两种类型对临床治疗和疾病预后有重要指导意义。一般对HA-MRSA和CA-MRSA的区分主要采用美国CDC的标准[10]，然而在临床实践中，很多菌株会因病历资料不全而难以依据这一标准区分。通过对MRSA进行SCCmec分型发现，全球范围内HA-MRSA菌株主要为SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型，而CA-MRSA主要为SCCmec Ⅳ、Ⅴ型[11]。这种特定的SCCmec型别特征为临床HA-MRSA和CA-MRSA的区分提供了重要的分子水平证据，相对客观。因此，有学者[12]提议对HA-MRSA和CA-MRSA的区分采用临床资料加SCCmec分型相结合的方法。本研究的95株MRSA中HA-MRSA和CA-MRSA分别约占23.15%和76.84% ；其中SCCmec Ⅳa型65株，占68.42%，是主要的SCCmec基因型。

多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是1998年Maiden等首次应用于脑膜炎奈瑟菌分型的一种基于核酸序列的新型分子分型方法，与其他方法相比，具有分辨率高，数据可靠，重复性好，便于不同实验数据比较，有利于全球范围的分子流行病学数据标准化的优势。MLST通过分析选定的7个管家基因序列，将全球金葡菌分为十几个不同的克隆集群(Clone Cluster，CC)，每个CC都有其独特的流行区域，能较好地分析菌株间亲缘关系[13]。本研究结果显示，深圳地区儿童MRSA分离株有10种ST型，分别包含在6大克隆群(CC59、CC5、CC5、CC398、CC88和CC25)中。其中ST59、ST45、ST1和ST338共83株，占87.36%，分别属于CC59(ST59和ST338)、CC5(ST1)和CC45(ST45)3个主要克隆群。ST59型共检出46株，占48.42%，是优势序列型，也是我国CA-MRSA最见的基因型[14]。研究表明[15]，ST59较其他ST型有更强致病性，从而导致这一克隆在我国儿童中广泛流行。金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcus aureus Protein A，spa)基因分型方法是基于单个基因位点的扩增测序方法，远远少于MLST 分型方法的7个基因位点，所以具有快速简单、重复性好、分型结果数字化的优点，而且成本较MLST分型低很多，便于不同实验室间的比较，spa 分型方法目前已经被广泛应用于许多实验室。本研究的95株MRSA临床分离株有19种spa型，其中t437型51株，占53.68%，是最主要的spa基因型。与国内学者李敏豪[16]、李文婷等[17]报道广州、北京等地区儿童MRSA感染的临床分离株分子类型ST59-SCCmecⅣ-t437基本一致，只是比例不尽相同。Wang Xing等[18]分析了27例血流感染社区获得性MRSA临床分离株，结果显示，ST59-Ⅳ/Ⅴ-t189是最主要的克隆。

2012年，刘颖超等[19]报道了2005～2009年中国7个城市儿童MRSA感染分离株的流行克隆为ST59-MRSA-Ⅳa(t437)和ST59-MRSA-Ⅲ(t037)，可能分别属于社区获得性MRSA与医院获得性MRSA。Kang S等[20]报道，韩国儿童鼻腔定植的MRSA和临床分离株克隆类型都是ST72-SCCmec-Ⅳ，这是在韩国流行的CA-MRSA流行株[21]。目前，全世界报道的CA-MRSA分子型别超过20种，其中ST59-IV型和ST59-V型是中国(包括台湾地区)和其他几个亚洲国家流行的两个主要分子型别[22]。

MRSA的耐药情况越来越严重，本研究的95株MRSA临床分离株中对β内酰胺类抗菌药物100%耐药，呈现多重耐药的有80株，高达84.21%；其中对β内酰胺类抗菌药物、林可霉素类和大环内酯类同时耐药高达83.15%，同时对β内酰胺类、林可霉素类、大环内酯类和四环素类呈多重耐药的为32.02%，这当中包含了很多儿科常用抗生素，如阿莫西林、氨苄西林、罗红霉素等；还对利福平和复方磺胺甲噁唑等抗菌药物分别有不同程度的耐药，且不同分子类型对抗菌药物的耐受情况不同，未发现对万古霉素、利奈唑胺等耐药菌株。

目前，儿科临床分离到的多重耐药菌中MRSA依然是主要病原菌，给临床治疗带来的严重困难，如果监控不当，可能会引起院内感染或社区暴发。无论抗生素的使用是否合理，都会对细菌产生生存压力，但掌握本地区临床分离株的耐药情况，合理使用抗生素，对耐药菌株比例的减少和出现时间的延长大有帮助。因此，加强对不同地区MRSA分子特征的监测以及分析临床分离株的抗菌药物耐受情况对指导临床用药十分必要。