LncRNA GAS5在足细胞损伤中的作用研究

韦美理，林栩

(1. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院附属医院肾内科，广西 百色 533000)

慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)越来越成为危害人类健康不可忽视的疾病，因此也备受全球卫生相关部门的关注。研究表明，全球CKD的患病率为8%～16%[1]，在中国，成人CKD患病率较高，老年人群尤为显著[2]。“肾脏疾病·改善全球预后(Kidney Disease·Improving Global Outcomes，KDIGO)” 组织2012年指南将CKD分为5期[3]，CKD一旦进展至5期(肾衰竭期)时将面临肾脏替代治疗，随之而来的各种并发症，包括疾病本身引起的以及在治疗过程中引起的，如心脑血管疾病、感染、水电解质及酸碱平衡紊乱等，是导致终末期CKD患者死亡的主要原因。因此防治并发症及延缓CKD的进展是目前需攻克的一大难题[4]。

肾小球疾病是导致CKD的主要原因之一，无论原发性还是继发性的肾小球疾病，其共同特点是足细胞损伤继而出现蛋白尿，最终进展为CKD 5期。由此可知，足细胞与CKD的发生、发展密不可分，充分了解足细胞损伤的相关机制，从而通过早期防治可延缓慢性肾脏病的进展，甚至可能成为日后治疗CKD的关键。

人们越来越认识到，长链非编码RNA (long non-coding RNA，LncRNA) 在基本的生物学过程中起着至关重要的调节作用，因此，它们的失调可能导致包括肾脏病在内的主要人类疾病。因此，对 LncRNA 生物学的更多理解可能会为致病机制提供新的见解，从而为诊断和治疗提供新的机会。在这方面特别受关注的是长链非编码RNA生长阻滞特异性转录物5(LncRNA growth arrest-specific transcript 5，LncRNA GAS5)，它参与多种疾病的发病机制，其表达水平与临床病理特征和患者预后相关。LncRNA GAS5的生物学功能研究提示，LncRNA GAS5既抑制多种类型细胞增殖又促进其凋亡，而且这些细胞作用机制可能共同构成其抑制肿瘤作用的基础[5]。近年来，对LncRNA GAS5分子作用机制的理解取得了进展，如LncRNA GAS5能通过调控免疫细胞的增殖和活性来参与免疫应答，从而影响自身免疫性疾病的发生发展[6]。总而言之，LncRNA GAS5研究的结果具有改善疾病的诊断和治疗以及最终改善患者预后的潜力。为了说明这一观点，本文着重介绍了LncRNA GAS5的结构及生物学功能、其参与足细胞损伤的机制以及最终导致CKD的研究进展。

1 LncRNA GAS5 的基因结构

LncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，转录产物在剪接或不剪接后变为成熟的 LncRNA，带有或不带有poly(A)尾巴。LncRNA 位于细胞核或细胞质中，具有复杂且可变的功能。LncRNA GAS5是位于1号染色体长臂2区5带的一类LncRNA，除了能编码LncRNA外，还编码snoRNAs、microRNAs和piRNAs。LncRNA GAS5包含12个外显子和11个内含子，外显子仅包含一个短的开放阅读框，无编码蛋白的功能。然而，由于第7外显子中存在 5′-剪接供体位点，这些外显子被剪接后可以产生两个成熟的LncRNA，即GAS5a和GAS5b，其中GAS5b被认为是其主要转录物[1]。LncRNA GAS5的首个外显子中存在5′-末端寡嘧啶(5′-TOP)序列，LncRNA GAS5的生物学特征是由5′-末端的寡聚核糖核苷酸序列决定的[7]。5′TOP转录子能够被免疫抑制剂抑制自身的翻译，5′-TOP mRNA的另一个特征是其受到生长依赖转译的控制。此外，LncRNA GAS5的内含子能够编码10个人类或9个老鼠C/D框 snoRNAs，这些RNA参与rRNA的2’-O-甲基化；U44 snoRNA指导18S rRNA的修饰，剩余的snoRNAs直接修饰28S rRNA。此外，在这些snoRNAs中，U44、U74 和 U78可能是 microRNA 的前体[8]。既往研究也发现GAS5的mRNA水平在细胞生长抑制中有转录后积聚的现象[7]。

2 LncRNA GAS5 参与生物学行为的调控机制

研究证明，LncRNA 的表达不仅具有细胞特异性和组织特异性，而且在真核生物发育过程的特定阶段表达，即发育阶段特异性[9]。LncRNA 是许多生物学行为发生过程中的重要调控因子，例如蛋白修饰、转录和逆转录调控DNA 甲基化、细胞周期[10]。研究证明，LncRNA 与许多疾病的发生和发展有关，包括肾脏疾病[11-14]。LncRNA 可通过调节糖尿病性肾病中波形蛋白和肾素的表达来促进足细胞的上皮-间充质-过渡(EMT)过程，此外，与足细胞代谢变化的密切关系使LncRNA成为肾脏疾病发病机制中的一个重要环节[15]。LncRNA 在许多肾脏疾病的发生中起重要的调节作用，包括糖尿病性肾病、肾脏炎症和纤维化、肾细胞癌、肾损伤、肾移植排斥反应等[16]。LncRNA GAS5作为LncRNA中的一员，在多种急、慢性疾病的发生和发展过程中具有重要调控作用。LncRNA GAS5主要通过以下三种形式参与细胞生物学行为的调控。

2.1激活或抑制基因转录 LncRNA GAS5作为诱饵，与具有转录功能的调节蛋白结合并通过“滴定”的方式调节相关基因转录的激活或抑制。LncRNA GAS5于1988年由Schneider C等 在小鼠纤维母细胞NIH 3T3中首次分离出来，通过血清饥饿或雷帕霉素治疗后NIH 3T3细胞中LncRNA GAS5的表达呈上升趋势，且LncRNA GAS5还能引起T淋巴细胞的生长阻滞[17]。Tani H等[18]在人肾上皮细胞HEK293T中研究证实LncRNA GAS5可通过竞争性结合糖皮质激素受体而影响糖皮质激素诱导的蛋白激酶及其下游信号分子cIAP、SGK1的表达，并参与细胞增殖、离子通道以及细胞生长的调控。其还可以调节其他受体的转录活性，如雄激素、孕激素等[19-20]。有研究通过敲低人原代淋巴细胞和人T淋巴细胞系CEM-C7和MOLT-4中LncRNA GAS5的表达，再让这些细胞经过雷帕霉素处理后发现雷帕霉素的抑制效应被减轻50%以上以及雷帕霉素引起的细胞周期阻滞效应被消除，过表达LncRNA GAS5可诱导细胞凋亡增加和细胞周期受阻[19]。此外，有研究经过敲低细胞LncRNA GAS5的表达后再使用mTOR其它广谱抑制剂处理，发现LncRNA GAS5保护效应减低[9]。

2.2调控靶基因的表达 LncRNA GAS5可作为miRNA或剪切因子的诱饵，通过靶向结合miRNA而负性调控miRNA下游靶基因的表达。Gu J等[21]通过计算机软件分析出LncRNA GAS5存在miR-23a的靶向结合位点，通过RIP及双荧光素酶报告基因实验验证了LncRNA GAS5与miR-23a之间的相互关系，在乳腺癌MDA-MB-231细胞中发现LncRNA GAS5可通过海绵样吸附作用降低胞内miR-23a水平，促使ATG3表达及自噬活化并抑制肿瘤细胞生长。Wang YF等[22]通过TargetScan发现LncRNA GAS5具有一个miR-155的结合位点，他们使用miR-155模拟物的外源转染后，发现髓核细胞中的LncRNA GAS5表达水平显著降低，他们还发现LncRNA GAS5的过表达通过下调Bcl-2和上调caspase-3导致人类椎间盘原发性髓核细胞凋亡增加。

2.3参与基因表达的调控 Kim H等[23]研究发现LncRNA GAS5和c-Myc RNA直接结合而抑制c-Myc进入多聚核糖体，从而可负性调节eIF4E下游靶基因c-Myc的翻译。LncRNA GAS5在乳腺癌中的低表达可导致snoRNAs U50的低表达，这提示LncRNA GAS5可能通过snoRNAs U50发挥诱导细胞凋亡和阻滞细胞增殖等抑制作用。最新研究发现由GAS5编码的snoRNA SNORD44，在头颈鳞状细胞癌中低表达，且表达水平与患者预后呈负相关[24]。LncRNA GAS5可通过mTOR通路调节细胞的生长，具有调节细胞周期和细胞凋亡的功能，LncRNA GAS5还可能通过调控snoRNA来发挥其生物学功能[25]。此外，LncRNA GAS5 已被证明在基质干细胞分化中发挥重要的调节作用[26]。Fang Y等[27]研究发现LncRNA GAS5可通过抑制PTEN表达并导致败血症诱导的足细胞损伤。

3 LncRNA GAS5与足细胞损伤

3.1LncRNA GAS5通过PTEN 参与的足细胞损伤 人第10号染色体上缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物 (PTEN)基因是PI3K/AKT信号通路的负调节剂。PI3K/AKT信号通路在细胞存活、增殖及凋亡中起着重要作用[28]。PI3K/AKT信号通路在肾小球足细胞自噬作用中充当着特别的角色，调控着足细胞的生长、分化及凋亡。足细胞裂孔蛋白CD2AP和肾病蛋白 (nephrin)复合体可以与PI3K-P85亚基结合，参与并激活PI3K/AKT依赖的信号转导途径，调控足细胞的凋亡[29]。有研究还发现活化的PI3K/AKT通路可通过损伤足细胞从而引起蛋白尿的形成[30]。PTEN在糖尿病性肾病的足细胞损伤中起保护作用，而PTEN缺失则刺激蛋白尿的发生。此外，PTEN 缺乏会促进细胞骨架重塑，进而加速糖尿病性肾病的发展[31]。

有学者研究使用脂多糖(LPS)刺激足细胞后发现，在LPS诱导的足细胞中LncRNA GAS5的表达以时间依赖性方式下降，24 h后LncRNA GAS5的表达水平明显下调[31]。研究者们还将足细胞中的LncRNA GAS5敲低，发现LncRNA GAS5 敲低显著抑制足细胞中肾病蛋白的表达，这表明下调的LncRNA GAS5可能介导了足细胞的损伤[31]。学者们还发现抑制LncRNA GAS5可以显著增强足细胞的损伤程度，这表明败血性肾损伤中LncRNA GAS5的抑制作用可能会破坏足细胞[31]。同时，LncRNA GAS5 敲低后PTEN 被下调，而PI3K/AKT则被激活。PTEN 通常被认为是 PI3K/AKT信号通路的负调节剂，它通过去磷酸化与 PI3K 拮抗，在3′-羧基位点形成 PIP2，从而对PI3K/AKT途径产生负调控[28]。研究者通过生物信息学分析预测发现了LncRNA GAS5启动子序列中存在PTEN的结合位点。更重要的是，PTEN 的过表达可以逆转 GAS5对PI3K/AKT激活的促进作用，进一步表明 LncRNA GAS5 对 PI3K/AKT途径的调节作用取决于PTEN[28]。总之，LncRNA GAS5通过抑制PTEN表达导致足细胞损伤。

3.2LncRNA GAS5通过CHOP参与的足细胞损伤 CHOP(C/EBP同源蛋白)是bZIP转录因子C/EBP家族的成员，与转录因子C/EBP1是异源二聚体，CHOP的表达受到多种细胞应激的影响。CHOP与C/EBP二聚化是通过阻止其DNA与基因子启动子结合而抑制C/EBP的功能，CHOP能与特定的DNA序列结合并刺激特定基因的转录，CHOP还与其它碱性区域亮氨酸拉链蛋白的非C/EBP亚家族相结合，如激活转录因子3和Jun/Fos，CHOP(C/EBP同源蛋白)是ER应激介导的凋亡通路的组成部分之一。已有研究表明，CHOP在ER应激细胞中通过真核翻译起始因子2(eIF2a)亚基的去磷酸化促进蛋白质合成，从而诱导死亡[32]。CHOP的异位过表达诱导成纤维细胞生长停滞，抑制脂肪细胞分化，并诱导体外凋亡。CHOP 在正常肾脏的足细胞中表达微弱，但在大多数蛋白尿患者肾脏和大鼠嘌呤霉素肾病中表达上调。营养缺乏后，CHOP 和 GAS5 的表达增加[33]。

超氧阴离子和过氧化氢增加了LncRNA GAS5和CHOP的 mRNA 和蛋白表达。有研究报道，LncRNA GAS5可能通过 snoRNA 调节 CHOP 的表达[34]； 在过表达 CHOP 的细胞中测定LncRNA GAS5表达，结果提示LncRNA GAS5表达下调，这表明CHOP对LncRNA GAS5表达的负反馈机制[35]。

4 小结与展望

LncRNA GAS5能够调控细胞增殖、凋亡、细胞周期等生命过程，与急性心肌梗死、脑血管疾病、高血压、糖尿病等多种疾病发生、发展及治疗密切相关，因此我们可推测其有望成为疾病精准靶向治疗的新靶标。尽管LncRNA GAS5在足细胞损伤作用机制的研究中取得了一些进展，但它在CKD的发生机制和诊疗价值尚不清楚，LncRNA GAS5作为细胞生长和凋亡的重要调节因子。目前的研究成果仍然给了我们信心，深入开展对LncRNA GAS5在足细胞损伤的分子机制研究有可能成为CKD精准防治的新靶点。