多技术联合检测产前9p三体胎儿1例

邱显荣 申 瑶

1.珠海市医学遗传研究所 珠海市妇幼保健院检验科，广东珠海 519001；2.广东省中医院 珠海医院检验科，广东珠海 519001

9p三体综合征（duplicationg 9p syndrome）由Rethor等[1]于1970年首次报道。1975年Centerwall等[2]确定了9p三体综合征的畸变类型，通常是亲代9号染色体与其他染色体的平衡易位所致子代染色体的部分三体表现，也有罕见的配子发生期不明原因的新发突变所致[3]。9p三体综合征是活产婴儿中仅次于21、18、13三体的较为常见的染色体异常，一种可能的解释是这些染色体和9p一样，基因相对贫乏[4-5]。迄今为止，已经报道的9p三体综合征200余例[6]。染色体微阵列分析技术作为一种新型的分子遗传学分析方法，能够检出包括三体、衍生染色体、微缺失、微重复、标记染色体等异常的染色体。本研究中，应用细胞遗传学技术联合CMA技术对1例无创提示9号染色体异常且超声心脏发育异常的胎儿进行遗传学分析，明确患儿异常染色体的来源及遗传学病因，为临床诊疗提供了依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

孕妇夫妇年龄分别为37岁和32岁，非近亲。既往体健，否认家族遗传病史。孕妇怀孕两次，曾剖宫产一女婴，健康。孕12+4周时NIPT报告21、18、13三体低风险，但提示9号染色体异常。孕23+4周B超示胎儿宫内发育迟缓、室间隔缺损、单脐动脉，不排除多囊肾、羊水少。孕妇在知情同意下行羊水穿刺术，抽取羊水同时做G显带核型分析和基因芯片检查。在得知核型分析和芯片结果后，孕妇和家属选择终止妊娠，引产一女婴。对孕妇及其丈夫抽外周血行G显带核型分析。

1.2 方法

1.2.1 NIPT评估胎儿常见染色体非整倍体患病风险 用EDTA抗凝的专用K管抽取孕妇外周血5 ml，2～8℃低温条件下离心分离血浆，-70℃以下超低温保存。采用深圳华大基因公司生产的“磁珠法DNA提取试剂盒”抽提含有胎儿游离DNA的孕妇血浆DNA，使用胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（华大基因）对母血游离DNA进行特定序列接头连接、扩增及上机测序，然后通过与阳性判断值比较进行胎儿21、18、13号染色体非整倍体情况的判断。应用BGISEQ-500基因测序仪（华大基因）进行测序，测序方法为联合探针锚定聚合测序法，测序深度为0.1×。

1.2.2 G显带核型分析 对胎儿取20 ml羊水做常规G显带核型分析。取孕夫妇外周血各2 ml均肝素钠抗凝处理，接种于广州和能生物技术有限公司生产的无血清外周血培养基进行培养。69～72 h收获，常规操作制备染色体，G 显带处理。非嵌合体计数20个核型，嵌合体计数100个核型。染色体核型参照人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN 2016）描述。

1.2.3 染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis，CMA） 抽取羊水10 ml，采用QIAamp DNA Mini试剂盒（德国QIAGEN公司）提取和纯化全基因组DNA，应用Affymetrix 750K试剂盒（美国ThermoFisher 公司）对DNA进行酶切、连接、PCR扩增、纯化、片段化、标记、杂交等处理，最后应用配套的ChAS软件分析染色体的拷贝数变异（copy number variation，CNV）。CNV的分析标准是以50个标记、100 kb为cut-off值进行分析；杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）或纯合状态（regions of homozygosity，ROH）以5 Mb的分辨率进行分析，包含明确印记致病基因的ROH区域报告标准染色体片段≥5 Mb，不包含明确印记致病基因的ROH区域报告片段为染色体片段≥10 Mb。

2 结果

2.1 NIPT检测结果

胎儿显示21、18、13三体筛查低风险，但9号染色体异常，见图1。

图1 胎儿羊水NIPT结果示意图：胎儿9号染色体拷贝数增加

2.2 核型分析结果

胎儿核型为：47，Xn，+9[82]/47，Xn，+del（9）（q13qter）[14]/46，Xn[4]，胎儿父母的核型结果未见异常，见图2。

图2 核型分析结果：47，Xn，+9[82]/47，Xn，+del（9）（q13qter）[14]/46，Xn[4]

2.3 CMA检测结果

对胎儿行羊水CMA分析，胎儿在chr9p24.3q34.3位置检出一段约137.5Mb的3拷贝重复，检测结果为arr[GRCH37]9p24.3q34.3（208454-141018648）x3，共 涉 及DOCK8、KANAK1、DMRT1等570个OMIM基因，见图3、表1。

表1 CMA检测结果

图3 胎儿CMA分析结果：羊水WGV示意图，箭头所示为重复区域

3 讨论

9p三体综合征是一种临床上很好描述的常染色体综合征，具有随年龄增长而变得更明显的颅面畸形的特征[7]。该综合征患者通常表现为生长发育迟缓、智力严重缺陷、具有眼间距宽、眼裂和嘴角下斜、杯状耳等头面部异常[8]、先天性心脏病、中枢神经系统异常、肾脏异常、骨骼畸形、泌尿生殖器异常等[9-10]。

9号染色体p22p24区是9p三体综合征的关键区域。谢娟等[11]认为9p22.1p22.3区段拷贝数的重复会引起典型颅面部异常。而9p22p24区段的DOCK8、KANK1、DMRT1、VLOLR基因明确与多种疾病及智力低下有关。DOCK8基因为制造DOCK8家族的蛋白质提供了指令，DOCK8蛋白在免疫系统的细胞中含量最多。这种蛋白在多种类型的免疫系统细胞，如T细胞、B细胞的生存和功能中起着至关重要作用。DOCK8基因的突变会导致DOCK8免疫缺陷综合征。它是一种免疫系统疾病，可导致反复严重的皮肤和呼吸道感染[12-13]。KANK1的拷贝数变异与中枢神经系统缺陷有关。Boxill等[14]认为9p区域包含一个或多个涉及脉络丛生长调控的基因，与9p三体相比，9p四体患者似乎更容易发生脉络丛增生（choroid plexus hyperplasia，CPH）。二者最常见的中枢神经系统异常是胼胝体异常和脑积水。DMRT1基因属于一个锌指样的DNA结合序列（DM域），DM域是脊椎动物性别决定途径中一个古老而保守的组成部分。当该基因CNV异常时，就会出现睾丸发育缺陷和XY女性化。Verheij等[15]认为9p染色体上某些基因的超表达可能导致睾丸功能低下和泌尿生殖系统异常。丁宇等[16]认为9p21.2p21.3区段重复与语言发育迟滞有关，而位于该区段的VLDLR基因拷贝数的改变可调节突触的可塑性并对海马的特殊学习和记忆功能发挥重要作用。从而影响智力和骨骼的发育。本研究中胎儿的双亲染色体正常，其核型中的9p多体属于新发突变。因其覆盖了9p三体综合征的关键区域，故会呈现出与之相关的典型症状，是其发病的真正原因。

综上，准确和快速的产前基因检测可以让父母在知情的情况下做出决定。对正在进行介入性产前诊断和基因检测的父母进行遗传咨询时，除了常见的染色体畸变外，还应包括罕见的，但在临床上同样重要的相关基因组。染色体微阵列分析技术在临床中的应用将会明显提高不明来源复杂染色体畸变的诊断效率，为病因的解释、个体化的诊疗和遗传咨询提供科学合理的遗传学依据。