杧果C2C2型锌指蛋白MiLSDs的生物信息及胁迫响应分析

刘志鑫，孙 宇，叶 子，罗睿雄，李 忠，蒲金基，张 贺，龚德勇

(1.贵州大学 农学院,贵阳 550025；2.中国热带农业科学院 环境与植物保护研究所/农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海口 571101；3.中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所，海口 571101；4.贵州省亚热带作物研究所，贵州兴义 562400)

转录因子(Transcription factor，TFs)是植物中一类重要的调节基因，具有调控基因表达的功能，植物锌指蛋白是一类具有核酸结合作用的关键性调控转录因子，在植物的生长发育、生物及非生物胁迫调节中发挥重要的调控作用。锌指蛋白作为真核生物中种类最丰富的一类多肽结构蛋白,其经典的锌指结构是以Zn2+作为结合中心,在短距离内通过疏水作用与几种特定的氨基酸链螯合并折叠而形成稳固的“手指”构型；根据半胱氨酸(Cys)和组氨酸(His)的数量及位置，可将锌指结构域分为5亚类，其中C2C2型锌指由4个半胱氨酸残基结合一个Zn2+[1-2]。LSD1(Lesion simulating disease 1，LSD1)转录因子是一类特殊的C2C2型锌指蛋白，其特征是含有3个特殊的锌指结构域：CxxCxRxxLMYxxGASxVxCxxC又称为Zf-LSD1结构域,其锌指结构域由25个保守氨基酸残基组成，Zf-LSD1结构域通过抑制促死途径或激活抗死途径来调节转录，以响应病原菌诱导的超敏细胞死亡的细胞发出的信号[3]。Dietrich等[4]在1994年从拟南芥中分离了6种突变体(lsd1、lsd2、lsd3、lsd4、lsd5和T5121)，并将其命名为lsd型(lesion simulating disease resistance response)，随后Dietrich等[3]在1997年首次从拟南芥突变体lsd1中分离克隆出LSD基因。LSD转录因子可以作为促死亡信号的负调节因子，也可以作为植物细胞死亡保护基因的激活因子，其相关蛋白是对氧化应激反应的调节因子，特别是对植物超敏反应(Hypersensitive Response，HR)过程中形成的活性氧中间体(Reactive Oxygen Intermediates，ROI)的调节因子[5]。目前为止，拟南芥中已有5个基因被鉴定为LSD1类基因家族的成员[6]，其中3种包含2个或3个高度相关的锌指结构是植物特异性的，但其全基因组分析表明，拟南芥中共有12个LSD家族成员，剩余7个LSD家族成员的功能仍是未知的。拟南芥LSD1(AtLSD1)作为调节各种氧化应激来源反应的枢纽，在氧化应激反应中起中心作用[3-6]。Kliebenstein等[7]研究表明，AtLSD1是诱导铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)蛋白响应水杨酸(Salicylic acid，SA)信号通路的一部分并与lsd1介导的扩散细胞死亡结合从而间接抑制细胞死亡，Aviv等[8]证实AtLSD1(AT4G20380)负调控SA依赖信号导致细胞死亡。此外，LSD1还保留了一种基本的亮氨酸拉链转录因子AtbZIP10，LSD1和AtbZIP10这两种蛋白质在病原体诱导的HR和基础防御反应中都具有拮抗作用[6]。AtLSD1还对干旱和强光胁迫具有耐受性，在调节低温依赖的细胞死亡和冷应激反应与ROS相关细胞死亡之间的信号串扰中起着重要作用[9-10]。LSD1增强了与氧化应激相关的信号通路中的活性氧清除能力，减少由生物、非生物胁迫及病原菌侵染造成活性氧过度积累带来的伤害。近年来，关于LSD1转录因子功能的研究不断被报道，例如水稻[11]、大豆[12]、苦荞[13]、小麦[14]等。

杧果(Mangifera indica)为漆树科杧果属果树。杧果在生长发育过程中经常受到生物、非生物胁迫及病原菌侵染，严重时可导致杧果贮运期病果率高达30%～50%，甚至可达100%，造成巨大的经济损失[15]。随着全基因组测序技术的进步，Wang等[16]、Li等[17]分别完成了对杧果全基因组的测序工作，获得了基因组大小为393 Mb，20条染色体的杧果基因组图谱，这为深入了解杧果LSD(MiLSD)基因家族信息奠定了基础。本研究基于杧果全基因组信息，利用生物信息学方法对MiLSD基因家族进行鉴定与分析，包括生物信息、保守结构域、二级结构、三级结构、系统进化分析、病原菌侵染及激素处理分析，为解析MiLSD基因功能、遗传育种提供基因资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

试验材料取自农业农村部儋州市杧果种植资源圃贵妃杧果苗，1 a生幼苗，温室种植，对新抽的嫩叶进行处理，对照为0 h处理。以分生孢子为 2×106个/mL的胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)分生孢子悬浮液、2×107cfu的细菌性黑斑病菌(Xanthomonascitripv.mangiferaeindicae)悬浮液、以5 mmol/L水杨酸(SA)、5 mmol/L茉莉酸甲酯(MeJA)分别淋灌杧果苗嫩叶。每个处理分别对0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h时间点进行取样，剪取杧果苗叶片，液氮速冻，放入-80 ℃保存、备用。

1.2 方 法

1.2.1 数据来源 从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索获取杧果全基因组及转录组数据；从PlantTFDB v5.0(http://planttfdb.gao-lab.org/)中下载拟南芥、毛果杨、烟草、木薯、苹果、玉米、水稻、番茄、菠萝9个物种LSD蛋白的氨基酸序列。

1.2.2MiLSDs转录因子基因家族成员的鉴定 在Pfam(http://pfam.janelia.org/)中获得LSD蛋白特征性结构域，通过HMMER构建隐马尔可夫模型，在杧果蛋白数据库中搜索含有LSD特征性结构域蛋白并与拟南芥LSD基因家族成员的蛋白序列进行Blastp比对(E值为10-5)，然后通过CDD(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)检测是否含有LSD特征性序列，剔除不含特征性结构域的蛋白，最终得到MiLSDs基因家族成员。

1.2.3MiLSDs转录因子基因家族生物信息分析 使用ExPASy-ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)对MiLSDs转录因子成员进行理化性质的预测,包括氨基酸个数、基因长度、分子质量、理论等电点。通过在线网站SPOMA Secondary structure prediction(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)、SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)对杧果LSD蛋白序列的二级结构、三级结构进行预测。

1.2.4MiLSD转录因子基因家族系统发育进化分析 利用ClustalX软件对杧果、拟南芥、毛果杨、烟草、木薯、苹果、玉米、水稻、番茄、菠萝的LSD结构域蛋白序列进行多序列的比对，利用进化树分析软件MEGA 5.0对杧果与其他选定的9个物种采用邻接法(neighbor-joining NJ)构建系统进化树，使用在线网站iTOL(https://itol.embl.de/)美化进化树，并对MiLSDs基因家族成员进行分类及进化关系分析。

1.2.5 杧果叶片总RNA提取及cDNA第一链的合成 采用天根生化科技有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒中的方法提取杧果的总RNA。测定总RNA的浓度，-80 ℃保存，备用。采用天根生化科技有限公司的FirstKing cDNA第一链合成试剂盒中的方法反转录生成第一链cDNA，保存、备用。

1.2.6MiLSD转录因子基因家族实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及差异表达分析 利用Primer Primer 5.0软件对上述获得的杧果LSD转录因子序列进行引物设计(表1)，以杧果叶片cDNA为模板进行扩增。利用QuantStudio 6Flex的实时荧光定量PCR检测系统检测不同处理及病原菌侵染下MiLSDs的表达量，反应程序参照UltraSYBR Mixture试剂盒(北京康为世纪)。以杧果MiActin作为内参基因，0 h的表达量为对照，运用2-△△Ct法和SPSS1.0.0-118软件对各个样品Ct值进行数据统计及方差分析，计算MiLSD1、MiLSD2、MiLSD3的基因相对表达量。

表1 定量PCR引物Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

2 结果与分析

2.1 杧果LSD转录因子基因家族成员分析

在Pfam、CDD网站进行结构域预测中获得3个杧果LSD候选基因，并将其命名为MiLSD1、MiLSD2、MiLSD3。利用ExPasy网站对MiLSDs进行理化性质分析(表2)，结果表明，3个杧果LSD(MiLSD1、MiLSD2、MiLSD3)蛋白的氨基酸个数依次为110、94、165个，基因长度依次为 1 862、1 322、2 635 bp，分子质量依次为10.36～ 17.58 ku，理论等电点(pI)为8.73、6.68、8.93,其中MiLSD2理论等电点小于 7.000 0(由酸性氨基酸组成)，MiLSD1、MiLSD3理论等电点均大于7.000 0(碱性氨基酸组成)；不稳定指数依次为 58.32、48.51、46.45，不稳定指数平均值为 51.09，大于40，表明MiLSDs属于不稳定蛋白质；亲水性依次为-0.033、0.441、-0.100。亲水性的平均值为0.308，MiLSD2大于0，是非亲水性蛋白质，MiLSD1和MiLSD3是亲水性蛋白。

表2 杧果LSD转录因子基因家族成员信息Table 2 Information of LSD transcription factor family in mango

为进一步确定MiLSDs转录因子成员，通过NCBI检索及CDD网站检测，结果显示MiLSDs成员均含有Zf-LSD1结构域(图1)。MiLSD1有1个Zf-LSD1结构域，MiLSD2和含MiLSD3有2个Zf-LSD1结构域。

2.2 杧果LSD转录因子蛋白质序列比对及结构预测

为了解MiLSDs转录因子之间是否存在功能相似性，使用DNAMAN软件对杧果LSD转录因子蛋白质序列进行对比，结果显示(图2)MiLSD1、MiLSD2蛋白质序列相似，而MiLSD3蛋白质序列与MiLSD1、MiLSD2蛋白质序列存在较大差异。

SPOMA预测结果显示(图3)，MiLSD1蛋白二级结构的主要元件是α-螺旋(29.09%)，其次是延伸链(19.09%)和β-转角(4.55%)，其余的为无规则卷曲(47.27%)；MiLSD2蛋白二级结构的主要元件依次为延伸链约占28.72%、α-螺旋约占21.28%、β-转角约占8.51%、无规则卷曲约占41.49%；MiLSD3蛋白二级结构中，延伸链约占21.82%、α-螺旋约占15.15%、β-转角约占7.27%、剩余的氨基酸(约占55.76%)为无规则卷曲。

基于同源建模原理，通过SWISS-MODEL网站以6skf.25.A为模型对杧果LSD家族成员蛋白质进行三级结构预测。结果显示(图4)MiLSD1、MiLSD2的三级结构相似，而MiLSD3却与之不同，这与MiLSDs转录因子基因家族在二级结构的预测结果相吻合。

2.3 杧果LSD转录因子基因家族系统进化树分析

将杧果(3个LSD基因)、拟南芥(12个LSD基因)、毛果杨(15个LSD基因)、烟草(21个LSD基因)、木薯(6个LSD基因)、苹果(5个LSD基因)、水稻(12个LSD基因)、番茄(3个LSD基因)、菠萝(5个LSD基因)共82个LSD蛋白序列构建系统发育树(图5)。根据进化树分支将82个LSD基因划分为十类(ClassⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ)，MiLSDs分别分布在2个分支，MiLSD3与菠萝和苹果聚类在较小分支ClassⅥ；MiLSD1和MiLSD2与其他8个物种聚类在一个较大分支ClassⅨ。杨树LSD基因分布在ClassⅧ、Ⅹ；拟南芥LSD基因大部分分布在ClassⅠ；烟草LSD基因大部分存在ClassⅦ和Ⅹ；其余物种LSD基因在各个分支均有分布。

2.4 杧果LSD转录因子基因家族胁迫差异表达分析

荧光定量PCR分析MiLSDs在胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides，Cg)、细菌性黑斑病菌(Xanthomonascitripv.Mangiferaeindicae，Xcm)、水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)4个处理下各个时间段的转录水平。以MiActin为内参基因，0 h为对照组，使用2-△△Ct法计算MiLSDs基因表达量。结果显示杧果LSD转录因子基因家族不同成员在不同处理下的表达量存在差异性。

Cg处理结果(图6-a)表明，MiLSD1较MiLSD2和MiLSD3在整体侵染过程中表达量高，在侵染3 h、6 h、24 h、72 h时MiLSD1表达量明显上升且呈显著性，侵染12 h时表达量下降，在侵染48 h时表达量最低；MiLSD2在侵染3 h时表达量最高且呈显著性，随之表达量下调趋于一个较稳定的趋势；MiLSD3表达量虽呈上调趋势，但总体表达量较低，侵染72 h时表达量最低。Xcm处理结果(图6-b)表明,MiLSD2整体表达量比MiLSD1、MiLSD3高，且在3 h、6 h、24 h、72 h时表达量呈显著性；MiLSD1在24 h、48 h时表达量呈显著性，MiLSD3在24 h表达量呈显著性，其余时间段二者表达量均较低。SA处理结果(图6-c)表明，MiLSD1、MiLSD3分别在处理3 h、24 h时表达量呈上调，MiLSD1在6 h、24 h、48 h、72 h几乎表达量较低，MiLSD3在6 h、12 h、48 h、72 h几乎表达量较低；反之，MiLSD2整体表达量均上调，在12 h时表达量最高，随之较12 h呈下调趋势。MeJA处理结果(图6-d)表明，3个基因表达量除72 h外均显著上调，MiLSD1在6 h到48 h呈上升趋势，MiLSD2在3 h表达量最高，6 h到48 h表达量趋于稳定，MiLSD3在3 h小时表达量最高，6 h、12 h表达量大致相同，24 h和48 h表达量也相差不大。

3 讨 论

随着高通量测序技术的不断革新，目前被广泛应用于基因组和转录组的测序。本研究基于杧果全基因组信息鉴定并分析了3个MiLSDs转录因子，对其亲水性分析发现MiLSD2与ZmLSD1[18]都是属于非亲水性蛋白，由酸性氨基酸组成，其余2个则为亲水性蛋白；为进一步确定MiLSDs转录因子基因家族成员，对其保守结构域预测发现，MiLSDs转录因子基因家族成员具有高度保守的特征锌指蛋白，均包含zf-LSD1结构域CxxCxRxxLMYxxGASxVxCxxC[3]。Liu等[19]发现，含有3个zf-LSD结构域的蛋白质与仅含有1个zf-LSD1结构域的蛋白质在功能上有显著差异。大多数植物LSD基因都有3个LSD结构域，这些结构域在进化中是保守的，虽然对1个或2个LSD结构域的基因的鉴定表明，其结构在进化过程中同样保守，但LSD结构域数目对LSD基因功能的影响尚不清楚[20]。为了解MiLSDs转录因子基因家族成员之间的功能相似性，对其蛋白质序列进行比对及二级结构、三级结构预测发现MiLSD1和MiLSD2二级、三级结构相似，而MiLSD3却与之不同。因此，推测MiLSD1和MiLSD2蛋白质之间具有功能相似性。植物LSD1基因的进化可能是由两个全基因组复制事件(Whole Genome Duplication，WGD)决定的，这些蛋白质含有Zf-LSD1结构域的3个拷贝，在其整个多肽中起着调节疾病防御和细胞死亡的关键作用[4，14，19]。分析MiLSDs基因家族的系统发育树，发现在ClassⅥ分枝，MiLSD3表现出与菠萝同缘关系较近，而MiLSD1和MiLSD2的结构相似，聚类在ClassⅨ分枝中，表现出与杨树和木薯亲缘关系较近，与烟草和拟南芥较远。从系统进化树分析中可推测，MiLSD1和MiLSD2可能在其结构上具有相似的功能；另外，根据二级、三级结构分析也可以推测同一亚组间具有相似功能的成员在其结构上也具有一定的相似性。

植物在生长发育过程中常受到生物、非生物胁迫及病原菌侵染等，在植物响应这些胁迫过程中涉及复杂的调控机制，对杧果叶片进行病原菌(Cg、Xcm)侵染处理和激素(SA、MeJA)处理。荧光定量PCR分析结果显示，MiLSD1在真菌(Cg)侵染下基因表达量明显升高，这表明MiLSD1可能对胶孢炭疽菌侵染起正调控作用。在大豆锈病(Phakopsorapachyrhizi)侵染和脱水胁迫下大豆GmLSD的表达受到了一定调控，这表明，GmLSD基因参与了大豆对生物和非生物胁迫的反应[12]；小麦TaLSD基因的表达量与禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、白粉菌(Powedrymildewpathogen)和条锈菌(Striperustpanthogen)的侵染紧密相连[14]；拟南芥LSD1对霜霉菌(Downymildew)表现了很高的抗病性[4]；Wang[11]等研究表明，转入LSD1同源基因OsLSD1的水稻转基因植株对稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)的抗性增加，而OsLSD1在调节植物PCD中起负作用，但在愈伤组织分化中起正作用。MiLSD2在细菌(Xcm)和SA处理下表达量上调，表明MiLSD2参与了杧果对细菌性黑斑病的抗性和SA的胁迫响应，MiLSD2可能通过诱导SA来增加杧果对细菌性黑斑病的抗性；另外，Xcm处理条件下MiLSD2表达上调较SA处理高，说明该基因对不同的外界刺激具有不同的响应速度。AtLSD1基因通过积极响应SA信号，提升活性氧的清除以降低非生物胁迫的伤害[8]；在苦荞(Fagopyrumtataricum)中FtLSD1基因在SA和UV-B处理条件下表达上调，说明FtLSD1可能参与了苦荞的抗SA和UV-B的防卫反应[13]；但在玉米(Zeamays)中，ZmLSD1基因在玉米根和叶部中的表达量下调[18]，这说明LSD基因在不同物种中对SA的调控作用不同。在MeJA处理下MiLSD1、MiLSD2、MiLSD3的表达量均呈显著性，其中MiLSD3在MeJA处理下的3～48 h之间的表达量显著上调，且在3 h时达到最高峰，说明MiLSD3参与杧果对MeJA胁迫的响应，而且茉莉酸甲酯可能受MiLSDs的调控。

植物使用复杂的机制来平衡细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)水平的稳态[21]。在清除ROS的酶中，过氧化氢酶是一种高度保守的酶，催化过氧化氢(H2O2)转化为水和氧气，并在去除过量的H2O2中起关键作用[22]。LSD调节的细胞死亡长期以来一直与氧化应激有关，虽然LSD1的RCD表型是由超氧化物依赖性信号触发的[23]，但LSD1参与了上调铜锌超氧化物岐化酶(COPPERZINC SUPEROXIDE DISMUTASE)的信号传导途径，从而限制了细胞死亡的扩散[7]。此外，lsd1突变体在短期允许条件下表现出过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性降低，气孔电导降低[24]。这些结果表明LSD1可监测细胞内ROS的水平，从而调节不同类型的细胞死亡。本研究构建系统进化树显示，拟南芥的AtLSD1位于Class I分支，而杧果的MiLSD1，MiLSD2位于ClassⅨ分支，属于不同的进化分支，但MiLSDs均能响应SA的激活，尤其是MiLSD2，被激活后能持续上调表达72 h；而Kliebenstein[7]等研究认为，AtLSD1具有诱导CuZnSOD蛋白响应SA信号通路的功能；这说明不同进化分支的LSD家族基因成员在植物生长发育过程中所行使的功能有所不同，推测LSD蛋白与SA信号分子间存在互相调节的潜在功能。

本试验利用杧果基因组数据库，通过生物信息学手段在杧果基因组中鉴定出3个MiLSD基因(MiLSD1～3)，并进行了鉴定和分类，这3个基因存在于2个亚家族，保守结构域及二级、三级结构分析显示3个基因成员具有一定保守性；在Cg、Xcm、SA、MeJA处理下，成员间的基因表达存在一定差异，表明各基因间存在功能差异。杧果C2C2型锌指蛋白基因MiLSDs对不同的生物胁迫和激素处理表现出不同的表达特征，说明MiLSDs与杧果胁迫响应相关，但其确切的生物学功能，有待于进一步研究。