青稞耐低氮相关类甜蛋白基因HvTOND1克隆和亚细胞定位研究

安立昆，姚有华，姚晓华，吴昆仑

(1.青海大学 农林科学院，西宁 810016；2.青海省青稞遗传育种重点实验室，西宁 810016；3.国家麦类改良中心青海青稞分中心，西宁 810016)

青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.)，也称裸大麦，是最具有高原地区特色的重要粮食和饲料作物，青稞栽培历史悠久是高原农业文明的象征。通过长期的进化和栽培选育青稞完全适应了高原地区极端的气候，具有耐高寒、干旱、盐碱、贫瘠等特点[1]。青稞籽粒富含纤维素、蛋白质、维生素、β-葡聚糖，是人类非常理想的健康食品[2]。在高原地区青稞的产业发展直接影响着高原地区的粮食安全和经济发展，尤其是在高原农牧民扶贫、脱贫工作中有着重要的地位[3-4]。

氮元素是作物生长发育中最重要的大量元素，在植物三大营养素(氮磷钾)中排第一，也是作物生长和产量的主要限制因素之一[5]。青稞的主要产地都在生态极为脆弱的高原地区，对农业生产中过量的氮肥施用引起的生态环境问题更为敏感，高原地区农业生态环境的可持续发展直接影响着生态环境保护和地区经济发展。耐低氮基因TOND1(Tolerance of nitrogen defificiency 1)属于类甜蛋白基因家族。类甜蛋白是植物中一类抗菌蛋白的总称，属于病程相关蛋白PR-5家族参与植物应对多种病害，尤其是对真菌病害的防御过程[6-8]。水稻耐低氮基因OsTOND1是由Zhang等[9]采用籼稻‘特青’为背景的云南元江野生稻渗入系为材料，通过苗期和全生育期的耐低氮性状鉴定，并选用苗期对低氮敏感渗入系‘YIL105’与‘特青’杂交构建次级定群体进行精细定位克隆得到的一个水稻类甜蛋白基因，发现其主要在水稻新生的芽、根、茎、幼嫩叶片和幼穗中表达，采用洋葱表皮进行亚细胞定位研究发现其定位在细胞膜中，在水稻中过表达OsTOND1能提高水稻苗期耐低氮能力和大田成熟期的产量，采用RNAi干扰水稻中OsTOND1基因表达发现低氮条件下水稻苗期的根长、株高、干质量、氮浓度和植株总氮量和大田成熟期的有效穗数、每穗实粒数以及单株产量都明显下降，进一步研究发现OsTOND1启动子区3个SNP和编码区的2个SNP是含有TOND1基因的水稻品种耐低氮性增强的原因。

近年来各界高度重视化肥减施增效的研究与推广，化肥减施增效战略在高原地区生态文明建设有着重要的地位，减少高原地区农业生产中化肥施用，减少农业生产对环境的影响对于保护高原地区农业生态环境促进经济可持续发展具有重要作用。克隆和研究青稞耐低氮基因对研究青稞耐低氮机制以及利用分子育种技术培育耐低氮青稞品种有重要的推动作用，对于减少青稞生产中的氮肥施用，减少农业生产对生态环境的影响。促进青稞栽培区域的生态农业可持续发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

1.2.1 青稞DNA提取 参照天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒DP305说明书提取青稞叶片基因组DNA，提取的DNA放于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2HvTOND1基因克隆和启动子区域序列克隆 根据已报道的水稻耐低氮基因OsTOND1，将基因序列输入植物基因组数据库Gramene(http://www.gramene.org/)中大麦基因组数据中进行搜索获得大麦的HvTOND1基因，并根据大麦HvTOND1基因序列及起始密码子ATG前2 000 bp左右序列设计引物。基因克隆正向引物：F:5′-ACAGCACCACAGCAAGCAAG-3′；反向引物：R:5′-TCAGGGCGTGTGTCAAGGTT-3′。启动子区域序列克隆正向引物：F:5′-TGTCGATCGTGAGGAGCTGG-3′；反向引物：F:5′-CTTGCTTGCTGTGGTGCTGT-3′。采由于用HvTOND1不具有内含子所以采用KOD-FX高保真PCR酶以青稞‘昆仑14’基因组DNA为模板克隆青稞HvTOND1序列和启动子区域序列。对提取的青稞基因组进行PCR扩增，按以下程序进行扩增：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s,56 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min(扩增启动子区域序列为2 min)，35个循环；4 ℃保存。反应完毕，取5 μL PCR产物在含EB的10 g/L琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下检测。将PCR产物与pEASY-Blunt Cloning载体混合参照试剂盒说明书进行连接并转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并送测序。

1.2.3 青稞HvTOND1生物信息学分析 采用Gene Structure Display Server 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)对基因结构进行分析；采用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对启动子区域元件进行预测分析；采用Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)对蛋白理化性质进行预测分析；采用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对蛋白跨膜结构进行预测分析；采用kinasephos2(http://kinasephos2.mbc.nctu.edu.tw/)对蛋白磷酸化位点进行预测分析；采用SignalP(http://www.Cbs.Dtu.Dk /services /SignalP/)对蛋白信号肽进行预测分析；采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)对蛋白二级结构进行分析；采用同源建模软件Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org/)进行蛋白三级结构同源建模。采用DNAMAN 7.0将青稞 HvTOND1蛋白序列与小麦(Triticumaestivum)TaTOND1、黑麦(Secalecereale)ScTOND1、小米(Setariaitalica)SiTOND1、水稻(Oryzasativa)OsTOND1、高粱(Sorghumbicolor)SbTOND1、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)BdTOND1、节节麦(Aegilopstauschiisubsp.tauschii)AtsTOND1、玉米(ZeamaysL.)ZmTOND1、二型花DoTOND1(Dichantheliumoligosanthes)、羊黍PhTOND1(Panicumhallii)的蛋白序列进行对比并采用MEGA7中以最大似然法构建系统进化树。

1.2.4 青稞HvTOND1亚细胞定位研究 采用pBI221-GFP载体用于亚细胞定位研究，设计带有XbaⅠ的正向引物：5′-GCTCTAGAACAGCACCACAGCAAGCAAG-3′和KpnⅠ酶切位点的反向引物5′-CGGGTACCTGGGCAGAA GACGACTTG-3′采用高保真酶KOD-FX扩增HvTOND1的ORF区域，构建C端与GFP融合的表达载体。PCR扩增体系与HvTOND1基因克隆时体系相同。PCR产物和PBI221-GFP载体质粒经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后，分别回收片段混合后采用T4连接酶连接后转入大肠杆菌DH5α感受态中，选取阳性克隆，并进行测序 验证。

将水稻种子在30 ℃黑暗萌发15 d取叶片切成碎段(<0.5 mm)，总量5～10 g。加入5～ 10 mL酶解液28 ℃ 100 r/min缓慢震荡酶解 5～6 h，酶解后用40 μm滤网过滤，50 g离心 10 min。倒去上清，用预冷W5溶液10 mL洗涤2次，50 g离心5min，加入500 μL MMG溶液悬浮。镜检：40倍镜下，每个视野20～40个。取200 μL原生质体悬液加入10 μL质粒(500 ng以上)，取相等体积的PEG溶液混合，室温静置 30 min。用1 mL W5稀释原生质体，100 g离心 5 min去上清。加入1 000 μL W5洗1～2次。最后加入 1 mL W5溶液，转移到2 mL 离心管中，28 ℃暗培养 24～48 h，激光共聚焦显微镜 观察。

2 结果与分析

2.1 青稞 HvTOND1基因和启动子区域序列 克隆

通过PCR分别扩增出片段大小为619 bp的基因片段和2 080 bp的启动子区域片段(图1)。将扩增得到的片段连接入pEASY-Blunt Cloning载体中采用M13引物进行测序。

2.2 青稞 HvTOND1基因生物信息分析

2.2.1 青稞HvTOND1启动子功能元件预测 将克隆得到的HvTOND1基因启动子区域序列输入启动子元件分析网站PlantCARE中进行分析(表1)。发现HvTOND1基因启动子区域具有多种激素诱导表达元件。

表1 青稞 HvTOND1 启动子区域元件分析 Table 1 Structure of cis-acting elements in promoter region of HvTOND1 gene

2.2.2 HvTOND1蛋白理化性质分析 通过在线软件ProtParam分析OsTOND1和 HvTOND1蛋白的理化性质，OsTOND1由182个氨基酸组成，为疏水性稳定蛋白。HvTOND1由171个氨基酸组成，为亲水性稳定蛋白(表2)。

表2 水稻OsTOND1和青稞 HvTOND1蛋白质理化性质分析Table 2 Physical and chemical properties of OsTOND1 and HvTOND1 protein

2.2.3 HvTOND1蛋白跨膜结构分析 通过在线软件TMHMM Server v.2.0 网站 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)对OsTOND1和 HvTOND1蛋白跨膜结构分析发现OsTOND1有一个跨膜结构而HvTOND1不具有跨膜结构(图2)。

2.2.4 HvTOND1蛋白磷酸化位点预测 使用KinasePhos(http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/predict.php)预测OsTOND1和HvTOND1的磷酸化位点，发现OsTOND1有丝氨酸(Ser)3个，苏氨酸(Thr)2个，酪氨酸(Tyr)1个共5个磷酸化位点。HvTOND1有丝氨酸(Ser)1个，苏氨酸(Thr)2个，酪氨酸(Tyr)1个共3个磷酸化位点(图3)。

2.2.5 HvTOND1蛋白信号肽预测 采用在线软件SignalP-5.0(http://www.Cbs.Dtu.Dk /services /SignalP/)，对 OsTOND1和HvTOND1进行分析发现OsTOND1具有信号肽序列：MASAPAASPAVLVVVVLVASLAAGGANA，切割位点在第28至29位氨基酸之间。HvTOND1具有信号肽序列：MAASSSMLILLLAAALDADA，切割位点在第20至21位氨基酸之间(图4)。

2.2.6 HvTOND1蛋白二级结构预测分析 采用在线软件SOPMA分析OsTOND1和 HvTOND1蛋白二级结构发现OsTOND1蛋白的α螺旋、无规则卷曲、β转角、延长链分别占氨基酸总数的6.59%、50.55%、8.24%、34.62%。HvTOND1蛋白的α螺旋、无规则卷曲、β转角、延长链分别占氨基酸总数的12.87%、54.97%、3.51%、28.65%(图5)。

2.2.7 HvTOND1蛋白信号肽预测三级结构预测分析 采用在线软件Swiss-Model对青稞HvTOND1和水稻OsTOND1蛋白进行同源建模生成三级结构(图6)。

2.2.8 HvTOND1蛋白氨基酸序列对比分析 采用DNAMAN 7.0进行蛋白序列对比分析发现青稞HvTOND1与水稻OsTOND1一致性为58.24%，HvTOND1与其他物种的同源蛋白都具有信号肽和TLP-P结构域(图7)。

2.2.9 HvTOND1同源进化分析 将青稞HvTOND1与小麦(Triticumaestivum)TaTOND1、黑麦(Secalecereale)ScTOND1、小米(Setariaitalica)SiTOND1、水稻(Oryzasativa)OsTOND1、高粱(Sorghumbicolor)SbTOND1、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、节节麦(Aegilopstauschiisubsp.tauschii)AtsTOND1、玉米(ZeamaysL.)ZmTOND1、二型花DoTOND1(Dichantheliumoligosanthes)、羊黍PhTOND1(Panicumhallii)的TOND1同源蛋白序列输入MEGA7中构建系统进化树，发现青稞HvTOND1与节节麦AtsTOND1亲缘关系最近(图8)。

2.3 青稞HvTOND1亚细胞定位结果

采用水稻原生质体进行亚细胞定位发现在水稻原生质体内质网中有明显的绿色荧光信号，说明青稞HvTOND1定位于内质网中(图9)。

3 结论与讨论

HvTOND1属于类甜蛋白家族(Thaumatin-like protein)，类甜蛋白广泛分布于动植物和微生物中[10]。类甜蛋白家族在植物应对干旱、低温、病害等逆境中均能发挥功能，尤其是具有广谱抗真菌病害作用，此外类甜蛋白家族也广泛参与植物的生长发育过程调控[11-13]。植物类甜蛋白家族基因有10个具有共同起源的旁系类群构成，不同类群的类甜蛋白家族基因的功能发生高度分化[14]。类甜蛋白家族大多具有信号肽结构，是一种分泌蛋白可以在细胞外发挥作用[13,14-18]。

目前，大部分类甜蛋白家族研究都主要集中于抗真菌病害等领域，很多类甜蛋白家族基因被应用于培育抗真菌病害的转基因植物中[19]。目前，关于类甜蛋白在植物耐低氮中的功能研究报道极少。李健平等[20]采用race技术从香蕉EST文库中克隆到一个与香蕉抗病相关的类甜蛋白基因MaTLP1，该基因在根、球茎、假茎中表达量高，在叶、花、果实中表达量较低，并且发现在香蕉受古巴专化型尖孢镰刀菌感染时有强烈的诱导表达，认为该类甜蛋白在香蕉抗枯萎病中有重要的作用。马骊等[13]采用双向电泳结合质谱技术从低温胁迫下的油菜叶片中差异蛋白点,分离出一个耐寒相关类甜蛋白，命名为TLP，并进一步对TLP进行生物信息学和低温下的表达模式进行分析发现该类甜蛋白在油菜应对低温胁迫中有着重要作用。一些研究表明从大麦、苹果、樱桃、烟草等植物中发现一些类甜蛋白具有β-1,3-葡聚糖酶活性，并认为这与诱导植物抵御真菌病害有关[21]。很多研究表明一些类甜蛋白家族成员有木聚糖酶抑制剂活性或淀粉酶抑制剂的活性，可以抑制昆虫淀粉酶的活性，减少昆虫消化吸收营养成分达到抵御虫害的作用，此外很多植物中发现一些类甜蛋白家族成员是引起人类过敏的过敏源[14]。

目前，关于青稞中耐低氮相关类甜蛋白基因尚未见有研究报道，克隆和研究青稞HvTOND1对于研究青稞耐低氮分子机制具有重要意义。本研究根据已报道的水稻OsTOND1基因信息在植物基因组数据库中进行搜索获得了大麦的同源基因HvTOND1信息，并以此设计引物从青稞‘昆仑14’中克隆得到青稞HvTOND1基因序列信息。采用生物信息学软件对基因和蛋白结构及理化性质等进行预测分析发现HvTOND1基因不具有内含子。启动子区域上具有大量和激素有关的顺式作用元件。很多类甜蛋白家族的表达受茉莉酸和水杨酸等激素信号调控[14,22]，HvTOND1基因启动子区域序列元件预测也发现有8个茉莉酸和4个脱落酸的顺式作用元件，1个水杨酸和2个赤霉素作用元件，此外还有4个MYB转录因子结合位点以及1个细胞周期和种子特异性顺式作用元件。HvTOND1蛋白是一种分子量为18 022.24 u理论等电点为5.27的亲水蛋白。HvTOND1具有4个磷酸化位点，具有信号肽结构，但是不具有跨膜结构。通过与其他物种的同源蛋白序列进行对比并构建系统进化树发现其系统进化树分成两支小麦TaTOND1、小米SiTOND1、水稻OsTOND1、高粱SbTOND1、羊黍PhTOND1、二型花DoTOND1为一分支，玉米ZmTOND1、黑麦ScTOND1、二穗短柄草BdTOND1、节节麦AtsTOND1、青稞HvTOND1为另一分支，其中青稞HvTOND1与节节麦AtsTOND1亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示青稞HvTOND1定位于内质网中，而张阳军[23]研究发现水稻OsTOND1仅定位于细胞膜中。

青稞作为高原地区的特有作物，在青稞生产中避免过量施用氮肥造成对生态环境的破坏在生态极为脆弱的高原地区尤为重要。目前关于青稞中耐低氮基因的研究报道极少。本研究克隆了青稞耐低氮相关类甜蛋白基因HvTOND1，并进行生物信息学分析和亚细胞定位研究，为青稞耐低氮分子机制研究提供了一定的参考。