高压均质-冷冻干燥技术制备大豆分离蛋白微粒及其功能特性

肖志刚，王依凡，王可心，段庆松，朱旻鹏，霍金杰，江睿生，李 航，何 东，高育哲

高压均质-冷冻干燥技术制备大豆分离蛋白微粒及其功能特性

肖志刚1,2，王依凡1，王可心1，段庆松2，朱旻鹏1，霍金杰1，江睿生1，李 航1，何 东1，高育哲1※

（1. 沈阳师范大学粮食学院，沈阳 110034； 2. 沈阳农业大学食品学院，沈阳 110886）

为了进一步改善大豆分离蛋白的分散性及功能性质，该研究以大豆分离蛋白为原料，通过对天然大豆分离蛋白进行高压高剪切处理并联合冷冻干燥技术，制备大豆分离蛋白微粒，考察压力（60～100 MPa）对大豆分离蛋白微粒尺寸、功能性质及结构特性的影响，探究其构效关系。结果表明：随着压力逐渐增加，大豆分离蛋白平均粒径大幅度减小，粒径分布曲线向左侧移动，与天然大豆分离蛋白相比，在100 MPa时大豆分离蛋白粒径减小了1 631%，粒径曲线分布较宽。在60～100 MPa压力范围内随着压力的增加。与天然大豆分离蛋白相比，大豆分离蛋白微粒的分散性指数（Protein Dispersibility Index, PDI）和功能性质均显著提高（<0.05），其中在100 MPa时大豆蛋白质的溶解性提高了172.98%，乳化活性和乳化稳定性分别增加了约28.71%和77.82%，持油性增加了约123.76%，起泡性随时间的变化其泡沫高度也均有所提高。由扫描电镜图可以观察到，未经过高压均质的大豆分离蛋白粒子呈聚集状态，球状的表面向内凹陷，经过高压均质联合冷冻干燥处理后的大豆分离蛋白微粒呈现网络结构。在高压和高剪切力的作用下，大豆分离蛋白微粒的疏水基团大量暴露，表面疏水性随之增加，静电斥力增加，-螺旋和-转角向-折叠和无规则卷曲结构的转化是蛋白质的溶解性等功能性质提高的主要原因。溶解性等功能性质的提高有利于大豆分离蛋白更好的应用于食品加工行业，进一步为蛋白的理化性质及结构优化提供新思路。

蛋白；压力；大豆分离蛋白；微粒；溶解性；功能性质

0 引 言

大豆分离蛋白是优质的植物蛋白，具有丰富营养价值且价格低廉。但天然大豆分离蛋白存在大量疏水基团，与乳蛋白相比，其溶解性并不理想且待提高，功能性质不能得到很好地发挥[1-3]。蛋白质微粒化（micro-particulated）是通过各种物理、化学手段改变蛋白质的聚集方式，使蛋白质形成具有纳微尺度和相对有序、刚性空间结构的微粒[4]。蛋白微粒常用的制备方法有双乳化法、反溶剂法、机械法或通过相分离与其他高分子聚合物结合等[5]。双乳化法与反溶剂法都会引入其他化学试剂，相分离法需要控制好蛋白浓度，否则不容易制备成微粒化蛋白，传统机械法一般会与加热相结合。与这些处理改性方法不同的是，本研究利用高压均质-冷冻干燥联合技术制备大豆蛋白微粒，微粒产品性状更加轻薄，蛋白会在高压均质机内发生聚集或展开的一个瞬时高压剪切过程，蛋白部分的官能团暴露，使其功能性质及结构发生改变，同时具有微粒化程度高、不引入化学试剂等特点，与天然大豆蛋白质相比，经微粒化后的大豆蛋白微粒的粒径大幅减小，这有助于进一步提高蛋白溶解性和持油性等功能性质。

因此本文通过改变不同高压均质压力制备不同尺寸的大豆分离蛋白微粒，考察不同尺寸微粒形成前后溶解性等功能性质和结构特性的变化，探究其构效关系，揭示高压均质制备微粒化蛋白的机理。微粒化的大豆分离蛋白可作为植物蛋白配料应用于高蛋白饮料等食品中，起到增溶减沉、增强乳化效果等作用，为进一步拓宽大豆分离蛋白在食品行业的广泛应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白（蛋白质量分数93.06%，溶解性为33.60%）：得天力试剂有限公司；十二烷基硫酸钠，美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯，天津市永大化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高压均质机，宁波新芝生物科技股份有限公司；DWF-100型电动粉碎机，河北省科研仪器厂；ULTRA TURRAX®高速分散机，德国IKA公司；GL-21M高速冷冻离心机，上海市离心机械研究所；Ntcolet 5DXC红外光谱仪，美国Ntcolet Co公司；SU3500扫描电镜，日本日立公司；Zetasizer Nano ZS90分子粒度和zeta电位分析仪，英国Malvern公司；荧光分光光度计，上海棱光技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 高压均质联合冷冻干燥制备大豆分离蛋白微粒

将大豆分离蛋白作为原料，配制大豆分离蛋白分散液质量分数为3%，将大豆分离蛋白分散液在室温下用磁力搅拌器搅拌1 h，根据前期的预试验，经过不同压力（60、70、80、90、100 MPa）高压均质机均质后得到大豆分离蛋白微粒分散液，获得的大豆分离蛋白微粒分散液再进行冷冻干燥，然后将其过100目筛后获得大豆分离蛋白微粒。

1.3.2 大豆分离蛋白微粒的溶解性测定

根据文献[6]的方法进行修改，取0.1 g蛋白样品，加入10 mL蒸馏水，室温下磁力搅拌1 h，然后在19 200下离心10 min，收取上清液，用凯氏定氮法测得上清液中蛋白质含量（%）。根据以下公式计算蛋白质的溶解性（%）：

1.3.3 大豆分离蛋白微粒的乳化活性及稳定性测定

根据Song等[7]的方法进行修改，配置2 mg/mL大豆分离蛋白微粒溶液，将30 mL的样品溶液与10 mL大豆油混合均匀，使油的体积分数为30%。用高速分散机在10 000 r/min的转速下均质2 min。均质结束后，立刻（0 min）从得到的溶液底部取50L乳液加至5 mL 0.1%十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）溶液中，混匀，在波长为500 nm处测定吸光值。10 min后，再从得到的溶液底部取50L乳浊液加至5 mL 0.1%SDS溶液中，混匀，测定吸光值。初始时的吸光值为0，10 min时的吸光值为10，乳化活性（Emulsifying Activity Index）和乳化稳定性（Emulsion Stability Index）的计算公式如下：

式中2为固定系数；2.303为反应速率常数；为稀释倍数；为油脂占总数的比例；为光路长度，cm；C为蛋白质浓度，g/mL；0为初始时吸光值；为间隔时间，min；为吸光度差值。

1.3.4 大豆分离蛋白微粒的起泡性及泡沫稳定性测定

根据文献[8]的方法进行修改，配置5 mg/mL的大豆分离蛋白微粒溶液，用高速分散机在13 500 r/min的转速下分散样品溶液2 min，立即将起泡后的溶液倒入量筒中，记录随时间变化（0、10、20、30、40、50 min）其液面高度（mL）的变化。

1.3.5 大豆分离蛋白微粒持水性的测定

采用文献[9]的方法，称取0.1 g大豆分离蛋白微粒装入10 mL离心管中，记录此时大豆分离蛋白微粒与离心管总质量为1（g），向离心管中加入3 mL的去离子水，用涡旋震荡充分混合均匀后，在9 600下离心20 min，倒去上清液，记录此时离心管的质量为2（g）。持水性（%）用被吸附的水的质量和蛋白质的质量之比计算，按以下公式计算：

1.3.6 大豆分离蛋白微粒持油性的测定

采用文献[10]的方法并加以修改，称取0.1 g大豆分离蛋白微粒装入10 mL离心管中，记录此时大豆分离蛋白微粒与离心管总质量为3（g），向离心管中加入3 mL的大豆油，用涡旋震荡充分混合均匀后，在9 600下离心20 min，，吸去上层未吸附样品的大豆油，记录此时离心管的质量为4（g）。持油性（%）用被吸附的油的质量和蛋白质的质量之比计算，按以下公式计算：

1.3.7 大豆分离蛋白微粒的微观形貌观察

以扫描电子显微镜（Scanning Eectron Microscope，SEM）观察微粒粉体的微观形貌。取少量冷冻干燥后的微粒粉末以导电双面胶固定在样品台上，使用离子溅射仪对其表面进行喷金处理，喷金时电流设置为20 mA，时间为45 s，将喷好金的样品放入样品室，以15 kV的电压进行观察并拍照。

1.3.8 大豆分离蛋白微粒的粒度及Zeta电位测定

配置质量分数0.01%的大豆分离蛋白溶液，分散介质为水，在室温下磁力搅拌1 h，粒度大小分布及Zeta电位采用Zetasizer Nano ZS90分子粒度仪进行测定。

1.3.9 热稳定性测定

采用差示热量扫描仪（NETZSCH DSC 200 F3，美国TA公司）分析大豆分离蛋白微粒的热稳定性（Differential Scanning Calorimetry，DSC）。称取5 mg 左右的样品至铝坩埚中，然后将坩埚密封，加热温度为20～200 ℃，升温速率为10 ℃/min。

1.3.10 大豆分离蛋白微粒二级结构的测定

使用FT-IR光谱仪（AVATAR 370FT-IR，美国Ntcolet Co公司）分析样品的主要官能团。光谱记录在400～4 000 cm-1的范围内，分辨率为4 cm-1。同时利用Peakfit Version 4.12 软件进行谱图处理，采用分峰拟合的方法，计算出样品中二级结构组分的含量。

1.3.11 表面疏水性测定

依据朱明明等[11]的方法并修改，表面疏水性用8-苯胺-1-萘磺酸（8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）作为荧光探针进行测定。用磷酸缓冲液（10 mmol/L，pH值7.2）制备8×10-3mol/L ANS贮备液以及15 mg/mL蛋白微粒溶液。用磷酸盐缓冲液将上清液梯度稀释至0.005～0.500 mg/mL之间，取40L 8 mmol/L的ANS溶液加入到4 mL不同质量浓度的蛋白样品中，用涡漩震荡器充分混合。在390 nm（激发波长）和470 nm（发射波长）测量（20 ℃）荧光强度，狭缝5 nm，扫描速率10 nm/s。以荧光强度对蛋白微粒质量浓度作图，初始段的斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数。在用荧光分光光度计测定表面疏水性时，使用的是离心后的上清液，所以可以认为上清液中蛋白是完全溶于磷酸缓冲溶液。

1.4 数据统计分析

本试验数据均平行、重复测定3次，采用SPSS 22.0软件中方差分析法进行差异显著性分析，以＜0.05表示差异显著，通过Origin 8软件作图。

2 结果与分析

2.1 压力对大豆分离蛋白微粒的粒径及电位的影响

蛋白质平均粒径的大小直观反映了溶液中颗粒的大小，且对溶解性有至关重要的影响[12]。图1和表1表示经过高压均质处理的大豆分离蛋白平均粒径，随着压力的逐渐增加，大豆分离蛋白平均粒径大幅度减小，在100 MPa时与天然大豆分离蛋白相比粒径减小了约1 631%，且达到最小值295.7 nm。图1中的曲线表示，经过高压均质处理后的曲线向左侧移动，天然大豆分离蛋白颗粒分布较窄，粒径较大。这可能是由于天然的大豆分离蛋白的疏水基团在蛋白质内部，经过压力和剪切力的作用，蛋白质结构发生折叠，暴露出疏水基团。这与赵飞[13]的研究结果一致。聚合物分散性指数（Polymer Dispersity Index），代表聚合物粒径的均一程度，PDI 越大，粒径大小分布越宽；PDI 越小，粒径大小分布越均匀集中。由表1可知，随着压力的增加，大豆分离蛋白微粒均较天然大豆分离蛋白的PDI指数提高，阻止了聚集体的形成。

Zeta电位代表蛋白颗粒间相互吸引或排斥力强度及蛋白质带电性质，同时也是蛋白分散稳定性的重要指标，Zeta 电位的绝对值越高，体系就越稳定。经过高压高剪切的处理，大豆分离蛋白微粒Zeta电位的绝对值明显提高，它们具有更大的电负性，同时进一步增强了颗粒之间的静电斥力，这可能是分子间非共价键的相互作用使得大豆分离蛋白所带的极性基团更多暴露于蛋白分子表面，从而增加了蛋白表面的电荷数量，导致大豆分离蛋白微粒溶液的 Zeta 电位绝对值增大[14]，同时提高了其分散体系的稳定性。此结果和文献[15]的研究结论一致。

表1 不同均质压力下大豆分离蛋白微粒的平均粒径、PDI及Zeta电位

注：同列不同字母表示差异显著（<0.05），下同。

Note: Different letters in the same column indicate significant differences (<0.05). The same below.

2.2 压力对大豆分离蛋白微粒功能特性的影响

溶解性是评价蛋白质的重要指标，经过高压均质制备成大豆分离蛋白微粒后，其溶解性大幅度提高，当压力达到100 MPa时，大豆分离蛋白微粒溶解性达到最大值是91.72%，较天然大豆分离蛋白溶解性提高172.98%。这可能是由于压力的增加使蛋白分子展开，大量疏水基团暴露，增加了表面电荷，蛋白分子间静电斥力增加[16]，空间结构上蛋白发生一定程度上的先折叠再展开，二硫键断裂，蛋白质-水之间的相互作用增强，使大豆分离蛋白微粒的溶解有所提高。这与文献[17]得到的研究结果一致。在90 MPa时的溶解性略低于80 MPa，产生这种结果可能是在此压力时部分蛋白形成发生变性或形成聚集体。

乳化性能指油和水混合在一起形成乳状液的性能，具有良好的乳化性能可以改善食品的口感[18]。由表2可知随着压力的增加，大豆分离蛋白微粒的乳化活性与乳化稳定性均较天然大豆分离蛋白的有所提高，并在100 MPa时达到最大，其中乳化活性增大了约28.71%，乳化稳定性增加了约77.82%。导致这种结果的原因是经过高压高剪切，使蛋白的内部结构发生变化，疏水基团大量暴露，可以增强与油的相互作用[19-20]。起泡性能通过泡沫高度表征，并记录不同时间下泡沫的稳定性。经过高压均质处理后，在不同时间下蛋白起泡能力与对照比较均有显著增加，这是由于蛋白结构展开和以及表面疏水性的增强，从而使得蛋白质在气－水界面快速吸附。该结果与Xu等[21]的研究一致。在100 MPa时其起泡能力略有减小，影响起泡能力的因素多且不易控制，可能由于此时蛋白微粒的表面疏水性有所减小。

持水性（Water Holding Capacity，WHC）是代表着蛋白质吸收水分的能力，这是蛋白质在食品加工中非常重要的指标之一。表2显示，随着的压力的增加大豆分离蛋白微粒的持水性先增加后减小，但较天然大豆分离蛋白均大幅度减小。蛋白微粒的持水性与蛋白质构象、氨基酸组成、表面疏水性等相关[22]。经过高压均质处理后，由于其压力和剪切力的作用使蛋白质的疏水基团暴露，减少了水结合位点，从而降低了其水吸收能力[23]。

持油性（Oil Holding Capacity，OHC）在食品加工应用中也是很重要的指标，它可以增加香味物质的持久性、改善食品的口感等。由表2可知，随着压力的增加，大豆分离蛋白的持油性均高于天然大豆分离蛋白，在100 MPa时持油性增加了约123.76%，在经过高压高剪切处理天然大豆分离蛋白后，其蛋白结构展开，疏水基团暴露可以和更多脂肪相互作用。大多数天然蛋白质具有疏水中心，它无法与溶剂和环境接触的极性表面发生相互作用[24]。但由于蛋白质经过压力与剪切力的处理，使得疏水中心的氨基酸参与了反应，因此増加了大豆分离蛋白微粒的持油性。

表2 不同均质压力下大豆分离蛋白微粒的功能性质

2.3 压力对大豆分离蛋白微粒热稳定性的影响

通过采用差式扫描量热仪表征不同高压均质压力条件下的大豆分离蛋白的热力学特性，比较了天然大豆分离蛋白和大豆分离蛋白微粒的变性温度（）和热焓值（Δ）。表3显示，随着压力的增加，大豆分离蛋白的变性温度差值不大，波动范围仅在10 ℃以内。同时，不同压力条件下的大豆分离蛋白的热焓值（Δ）与天然大豆分离蛋白相比均有所提高，但压力为60 MPa与天然大豆分离蛋白的焓值无明显变化。这种现象主要是因为压力破坏了蛋白的构象，导致蛋白质热焓值改变，说明维持蛋白质结构稳定的氢键断裂，发生的吸热反应更强烈，热焓值较天然大豆分离蛋白有所增加。刘丽莉等[25]也得到了与本文相似的研究结果。

表3 不同均质压力下大豆分离蛋白微粒的热稳定性

2.4 大豆分离蛋白微粒二级结构的分析

由图2可知，大豆分离蛋白在酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带、酰胺Ⅲ带均有振动[26]，波数在1 300 cm-1左右有明显吸收峰出现，这表明在C-H面内产生弯曲振动，C-O、C-X（卤素）等伸缩振动，以及C-C单键骨架振动等，波数在1 500 cm-1左右，该区主要包括C=C，C=N，N=N，N=O等的伸缩振动以及苯环的骨架振动（C=C），波数在3 300 cm-1左右，这代表不饱和碳（三键和双键、苯环）上的C-H的伸缩振动[27]，而这些峰并没有在天然大豆分离蛋白中出现，这表明经过高压均质处理过后的蛋白内部发生变性。由表4可以看出，经过不同压力处理后的大豆分离蛋白微粒-螺旋、-转角、-折叠和无规则卷曲均发生变化，其中-螺旋和-转角含量均有所下降，-折叠和无规则卷曲含量均提高，蛋白经过高压以及剪切力的处理，氢键会产生断裂现象，使蛋白发生了部分变性，因此其二级结构发生了改变。产生这种现象的原因与文献[28]研究的结论一致。

表4 不同均质压力下大豆分离蛋白微粒的二级结构组成及含量

2.5 大豆分离蛋白微粒表面疏水性

表面疏水性被用于测定蛋白微粒三级结构的变化，表征蛋白内部疏水基团的变化，这会进一步影响蛋白的功能特性[29]。如图3所示，随着压力的增加，大豆分离蛋白的表面疏水性均显著提高（<0.05），因此经过高压处理过的蛋白，大蛋白质聚集体被破坏，其部分结构会展开，内部的疏水基团大量暴露。当压力达到一定程度时，大豆蛋白的分子间就会出现解聚集现象，变成更小的亚基单位，蛋白质分子的二硫键、静电相互作用和氢键被破坏，蛋白质分子展开，蛋白质内部极性基团和疏水基团被暴露出来，这一定程度增强了溶剂与分子的相互作用，从而使得溶解性提高[30]。

2.6 大豆分离蛋白微粒的微观形貌

不同压力条件下的的大豆分离蛋白样品SEM图像（500倍和1 000倍）如图4a所示。从图中可以看出未经过高压均质的大豆分离蛋白粒子呈聚集状态，球状的表面向内凹陷，在经过高压及剪切力的处理后均呈碎片状态，分子聚集形成更多的片层块状结构，表面光滑。研究结果表明经过高压均质处理处理可使蛋白质球状致密结构遭到了破坏，使蛋白肽链打开，冷冻干燥后其形成无规则的团聚，产生不同形状和大小的块状结构，质地变得疏松。这一结果与赵飞[13]得到的结论一致。图4b显示当放大倍数为1 000倍时大豆蛋白微粒呈现网络结构，形成这种凝胶网络结构的原因可能是由于疏水基团等作用力缠结所形成的交联网络。当压力为70 MPa时其网络结构分布较均一且紧密，当压力增加到80～100 MPa时，孔隙越来越大，此时具有高度开放的微纳米孔隙结构[31]。

3 结 论

1）经过高压均质制备成大豆分离蛋白微粒，其粒径大幅度减小，分散性指数及Zeta电位绝对值也随之增加。因此蛋白的功能性质均明显增加，其中当压力达到100 MPa时，大豆分离蛋白微粒溶解性达到最大值，较天然大豆分离蛋白溶解性提高172.98%，乳化活性和乳化稳定性最大分别增加了约28.71%和77.82%，在100 MPa时持油性提高了约123.76%，而持水性有所降低。蛋白质的粒径减小，溶解性提高，有利于其在食品加工中应用。

2）在高压和高剪切力的作用下，部分蛋白内部发生变性，表面疏水性增加，因此大豆分离蛋白微粒的疏水基团大量暴露，同时由Zeta电位可以看出经过高压均质处理后蛋白分子间静电斥力增加，-螺旋和-转角向-折叠和无规则卷曲结构的转化是蛋白质的溶解性及功能性质提高的主要原因。

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Preparation and functional properties of soy protein isolate particles by high pressure homogenization-freeze drying technology

Xiao Zhigang1,2, Wang Yifan1, Wang Kexin1, Duan Qingsong2, Zhu Minpeng1, Huo Jinjie1, Jiang Ruisheng1, Li Hang1, He Dong1, Gao Yuzhe1※

(1.,,110034,; 2.,,110886,)

This study aims to improve the PDI and functional properties of soy protein isolate. The high-pressure homogenization combined with freeze-drying was used to prepare soy protein isolate particles. A structure-activity relationship was established to clarify the effect of pressure on the properties and structure of soy protein isolate particles after preparation. The results showed that the average particle size of soy protein isolate was greatly reduced, with the gradual increase of pressure, where the distribution curve of particle size moved to the left. The particle size of soy protein isolate was reduced by about 1 631% at 100 MPa, indicating a much wider curve distribution of particle size, compared with natural soy protein isolate. The PDI and functional properties of soy protein isolate particles were significantly improved, with the increase of pressure in the range of 60-100 MPa. The solubility of soy protein at 100 MPa, emulsifying activity, emulsification, and oil retention increased by 172.98%, 28.71%, 77.82%, and 123.76%, respectively, while the foam height also increased with time.The reason was that the unfolding of protein structure and enhanced surface hydrophobicity allowed the protein to be rapidly adsorbed at the air-water interface. Scanning electron micrograph demonstrated that there was an aggregated state in the soy protein isolate particles that had not been homogenized under high pressure, indicating that the spherical surface was recessed inward. Correspondingly, the soy protein isolate particles presented a network structure after the high-pressure combined freeze-drying process. The hydrophobic groups of soy protein isolate particles were exposed to a large amount, where the surface charge enhanced as the electrostatic repulsion increased, namely the surface hydrophobicity increased under the action of high pressure and shear force. The solubility and the improved functional properties depended mainly on the transformation of-helix and-turn to-sheet and random coil structure. It was a benefit to improve the functional properties and structural characteristics of soy protein. The finding can provide a sound theoretical basis in the extensive application of the food industry.

protein; pressure; soy protein isolate; microparticle; solubility; functional properties

肖志刚，王依凡，王可心，等. 高压均质-冷冻干燥技术制备大豆分离蛋白微粒及其功能特性[J]. 农业工程学报，2021，37(13)：306-313.

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.13.035 http://www.tcsae.org

Xiao Zhigang, Wang Yifan, Wang Kexin, et al. Preparation and functional properties of soy protein isolate particles by high pressure homogenization-freeze drying technology[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(13): 306-313. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.13.035 http://www.tcsae.org

2021-01-19

2021-06-08

国家自然科学基金（32072139）；辽宁省农业攻关及产业化指导计划项目（2019JH8/10200020）；辽宁省科学技术计划项目-区域创新联合基金（2020-YKLH-35）；辽宁省重点研发计划项目（1584949193607）；沈阳师范大学博士科研启动项目（BS201517）

肖志刚，博士，教授，研究方向为粮食油脂及植物蛋白工程。Email：zhigangx@163.com

高育哲，博士，讲师，研究方向为粮食油脂及植物蛋白工程。Email：gaoyuzhe_66@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.13.035

TS214.2

A

1002-6819(2021)-13-0306-08