常温小麦挥发物及其对锈赤扁谷盗引诱率和触角电位影响的研究

肖惠惠，曾芳芳，王殿轩*，黄依林，白春启，赵 超，唐培安

1.河南工业大学 粮油食品学院，粮食储藏与安全教育部工程研究中心，粮食储运国家工程实验室，河南 郑州 450001 2.江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏 南京 210023

害虫对物质气味的反应及行为既关系到储粮昆虫化学生态行为表现，也关系到储藏物料对害虫易感染物质和害虫综合治理中一些特性物质的利用。碎小麦中二氯甲烷提取物对玉米象、锯谷盗、赤拟谷盗、锈赤扁谷盗有引诱作用[1]，燕麦挥发物对锯谷盗和大眼锯谷盗有很强的引诱作用[2]，80 ℃时玉米、小麦和稻谷的挥发物2-乙基己醇、(+)-δ-荜澄茄烯、胡椒酮和柠檬烯对米象和玉米象有不同程度的定向引诱作用[3]，但天堂椒挥发物对米象有驱避作用[4]。65 ℃时全麦粉、黄豆粉、玉米粉、荞麦粉、小米粉和高粱粉的萃取挥发物可显著引诱长头谷盗雌、雄成虫[5]。三七、当归、天麻和前胡等中药材的挥发物对药材甲引诱作用明显[6]。高温下储藏物粮食的挥发物对害虫具有引诱作用，同种谷物对不同害虫的引诱作用也存在差异。常温下谷物中挥发物种类与数量显著减少，对害虫的引诱影响程度也不相同[7]。锈赤扁谷盗(Cryptolestesferrugineus(Stephens))是一种世界性发生的常见储粮害虫，其成虫和幼虫均可危害破碎谷物、豆类、油料等，当种群密度较大时易引起储粮发热霉变，甚至严重影响粮食安全储藏，造成经济和粮食质量损失[8-13]。当前通常采用化学方法防治此类害虫，锈赤扁谷盗对常用熏蒸剂磷化氢的抗药性普遍且严重[14-16]，采集于山西省吕梁地区的锈赤扁谷盗品系抗性系数为敏感品系的668倍[14]，采集于湖北省麻城地区锈赤扁谷盗品系的抗性比敏感品系高838倍[17]。锈赤扁谷盗的熏蒸难度远高于其他害虫[18]，由此导致熏蒸失败的案例常有发生[19]。

昆虫可通过其嗅觉感知食物从而做出行为反应[2]，利用昆虫选择取食或产卵场所等习性，研究储藏物粮食中的挥发性引诱物有望用于诱捕、防治害虫来降低和控制害虫种群密度，减少化学药剂使用。有些储藏物甲虫对食物挥发物的趋向性反应已有报道，但关于锈赤扁谷盗对食物挥发物的电生理反应的研究缺乏。作者研究了常温下不同破碎程度小麦的挥发性物质成分与相对含量，并研究了锈赤扁谷盗对相对含量较高物质的触角电位反应，以期为分析和明确该害虫的有效引诱物质提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

试验所用锈赤扁谷盗采自河南新乡某粮库中，在河南工业大学昆虫培养室中培养数代，培养条件为(28±1) ℃，RH75%±5%，全黑暗，喂食全麦粉∶燕麦∶酵母∶碎麦质量比为5∶3∶1∶1的饲料。以羽化2周锈赤扁谷盗成虫为试虫。

1.2 样品

采用的小麦为当年收获的新麦品种208，水分含量12.5%，以完整小麦、破碎小麦和全麦粉为试验材料，碎小麦为粉碎后过直径为2.0 cm和1.5 cm 筛的中间分离物，全麦粉采用锤式旋风磨将其粉碎成粉末状态。备好的材料装入干净自封袋中放入-20 ℃冰箱1个月以消除其中可能的昆虫感染，试验前平衡至室温。

1.3 主要试剂

石蜡油(标准品)、反式-2-癸烯醛(纯度>93%)：北京百威灵科技有限公司；柠檬烯(纯度≥97%)、正己醇(纯度≥99%)、1-辛烯-3醇(纯度≥98%)、壬醛(纯度≥98%)、戊醛(纯度≥97%)、辛醛(纯度≥99%)、庚醛(纯度≥99%)：Sigma-Aldrich。

1.4 仪器与设备

BLH-5601锤式旋风磨：浙江伯利恒仪器设备有限公司；QP2010气相色谱仪：日本岛津有限公司；DG8W显微镜：舜宇仪器有限公司；DGX-8243B电热鼓风干燥箱：杭州汇尔仪器设备有限公司；57348-U固相微萃取头：美国Sigma-Aldrich集团有限公司；Y型嗅觉仪：郑州晶林科技有限公司；FW135植物微型粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；ACO-318气体循环气泵：广东海利集团有限公司；FCD-217SE冰箱：海尔电冰柜有限公司；SHP-350生化培养箱：上海精宏试验设备有限公司。

1.5 挥发物成分测定

采用顶空固相微萃取(HS-SPME)技术结合气相-质谱法(GC-MS)对样品的挥发物成分进行测定。 称取10.00 g样品于60 mL的顶空萃取瓶中，加紧瓶盖后于(28±1) ℃下平衡24 h，再将萃取头插入顶空瓶中萃取30 min，于GC-MS进样口250 ℃下解析2 min。分析中色谱柱为DB-5MS石英毛细管柱(0.25 mm×30 m×0.25 μm，Agilent)。进样口温度250 ℃，不分流，色谱柱起始温度50 ℃，以4 ℃/min升温至125 ℃，保持3 min，又以4 ℃/min升温至165 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min升温至250 ℃，保持5 min。载气采用高纯度氦气，柱压为87 kPa。不分流进样2 min，柱流量1.5 mL/min。接口温度250 ℃，离子源温度200 ℃；电离方式为EI，电离能量70 eV，扫描范围m/z35～350 amu；采用全扫描采集模式。

1.6 选择反应测定

采用臂长8 cm，内径1 cm，两臂夹角75°，柄长8 cm的Y型嗅觉仪。每个管臂各接一个特制200 mL的味源瓶，将20 g食料放入味源瓶作为处理，经活性炭过滤的净化空气作为对照，通过流量计控制气流速率为200 mL/min，管柄接真空泵。试验环境为 (28±1) ℃、RH60%～70%和全暗光。

逐头引进饥饿24 h的锈赤扁谷盗雌或雄成虫于Y型嗅觉仪管柄处，观测试虫爬至超过Y型支臂长度的2/3且1 min内不返回者记为有选择反应，5 min内无选择者视为不反应。雌、雄成虫各以20头为1组，共进行3组平行。其中，每测5头试虫调换一次Y型管方向，每测10头用无水乙醇擦洗管路内外壁，完全干燥后再用。试虫对不同物质的选择反应参数按下式计算。

选择系数=(处理臂管中虫数-对照臂管中虫数)/反应总虫数；

引诱率=处理臂管中虫数/总测试虫数×100%；

反应率=(处理臂管中虫数+对照臂管中虫数)/总测试虫数×100%。

%

1.7 锈赤扁谷盗对不同破碎度小麦及其中挥发物的触角电位反应测定

用解剖刀将锈赤扁谷盗雌或雄成虫触角从基部取下，切除末端一节，用导电胶将其两端黏合到电极两端，气味管口与触角间距为1 cm。将样品管的末端连接在触角电位仪气体刺激控制装置上，在测定锈赤扁谷盗对不同破碎度小麦的触角电位时，以空气为对照；在测定锈赤扁谷盗对小麦挥发物的触角电位时，将柠檬烯、正己醇、壬醛、1-辛烯-3-醇、戊醛、辛醛、庚醛和反式-2-癸烯醛分别用液体石蜡配制成0.1、1.0、10.0 μg/μL 3种不同质量浓度的溶液，将10 μL待测挥发性物质滴在宽4 mm、长3 cm滤纸条上，并等待其被滤纸完全吸收，以10 μL石蜡油为对照。每次刺激0.5 s，间隔为60 s。待显示器上基线稳定后给予刺激，测试锈赤扁谷盗对每个样品的触角电位反应，每个处理测试触角15根，每个样品平均刺激3次。将每一个样品测定值的平均值减去前后2次对照测定值的平均值即得触角电位反应的绝对值。测试的样品有完整小麦、破碎小麦、全麦粉，以及常温下小麦中的主要挥发物。

1.8 数据处理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 20.0对数据进行整理及χ2检验，并采用Duncan多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 常温下小麦挥发物的种类与相对含量

采用固相微萃取法和气质联用法对不同破碎度小麦挥发物的种类与相对含量进行分析，结果如表1所示。在常温下当年收获新麦品种208的完整小麦、破碎小麦和全麦粉的挥发物种类分别为17、20、20种，相应属于烷、烯、醛、醇、呋喃5类物质，其中2, 4-二甲基-庚烷、3, 3-二甲基-己烷和反式-2-癸烯醛在完整小麦中未检出，说明小麦破碎或粉碎后其中的挥发物成分会有所增加，增加的原因应为原有种皮封锁的成分在破碎后得到了释放，且其也有较高的相对含量。在相对含量变化上，完整小麦所检测出的挥发物质相对含量在破碎后变化各异。小麦破碎或粉碎后部分物质(如壬醛、2, 4-二甲基-庚烷等)相对含量升高，其可能主要原因为籽粒破碎后空间开放更多，物质挥发也更多所致。破碎后相对含量减小者则应为其总体含量相对稳定，破碎后总体物质增加导致其相对含量减小。

表1 不同破碎度小麦挥发物成分及相对含量
Table 1 Relative content of volatile components in different degrees of broken wheat

2.2 锈赤扁谷盗对不同破碎度小麦的选择反应

锈赤扁谷盗雌、雄成虫对不同破碎度小麦的选择反应如表2所示，在Y型嗅觉仪环境下，试虫对不同破碎程度小麦表现出不同选择行为，小麦破碎度大，相应的选择系数也大，说明小麦破碎程度增大会加大害虫对其挥发物的选择，雌虫对不同破碎度小麦的选择系数最大差值达0.20。同样，小麦对害虫的引诱率和反应率也随小麦破碎度增大而显著增加，雌虫对不同破碎度小麦的引诱率最大差值达0.12，反应率最大差值达0.06。小麦破碎后挥发物种类的增加或某些挥发物含量的增加增大了对试虫的引诱作用，相应地反应率也增大。比较雌、雄虫对小麦选择反应可见，锈赤扁谷盗同样破碎状态引诱率和反应率均为雌虫略大于雄虫，即锈赤扁谷盗雌虫更易受到小麦挥发物引诱。

表2 锈赤扁谷盗雌、雄成虫对不同破碎度小麦的选择反应Table 2 Selective responses of females and males of Cryptolestes ferrugineus to different degrees of broken wheat

2.3 锈赤扁谷盗对不同破碎度小麦的触角电位反应值

图1显示，小麦从完整籽粒至全麦粉的破碎度变化使得锈赤扁谷盗雌虫的触角电位反应值从0.131 mV增加至0.147 mV，雄虫的(EAG)从0.091 mV增加至0.120 mV。小麦破碎度增大后，其挥发物质种类和数量增多，相应地加大了锈赤扁谷盗触角电位反应值的升高幅度，且同样情况下雌虫的触角电位反应值大于雄虫的。

图1 锈赤扁谷盗雌、雄成虫对不同破碎度小麦的触角电位反应Fig.1 EAG responses of females and males of Cryptolestes ferrugineus to different degrees of broken wheat

2.4 锈赤扁谷盗对小麦中主要挥发物的触角电位反应

选取小麦中相对含量较高的8种主要挥发性物质，检测了锈赤扁谷盗雌、雄虫对其不同浓度单品的触角电位反应，结果如表3所示。由表3可知，不同小麦挥发物单品均可以引起锈赤扁谷盗雌、雄成虫不同程度的触角电位反应，且同一物质不同质量浓度间的触角电位反应值也不同。在测试的3个质量浓度中，锈赤扁谷盗雌虫对其中柠檬烯、1-辛烯-3-醇，己醛和戊醛的触角电位反应值随挥发物质量浓度升高没有相应显著增加；对于正己醇、壬醛、反式-2-癸烯醛和辛醛，随着挥发物质量浓度的变化，锈赤扁谷盗雌虫的触角电位反应值也发生相应的变化，当质量浓度增加到10.0 μg/μL时锈赤扁谷盗雌虫对触角电位反应值不再显著增加。锈赤扁谷盗雄虫对质量浓度为0.1 μg/μL的柠檬烯、己醛和反式-2-癸烯醛触角电位反应值较大，触角电位反应值随挥发物质量浓度升高没有相应显著增加；

壬醛和辛醛质量浓度为1.0 μg/μL时触角电位反应值显著高于0.1 μg/μL的，挥发物质量浓度持续增大到10.0 μg/μL后其触角电位反应值无显著增加；随着正己醇和1-辛烯-3醇挥发物质量浓度增加,雄虫对其触角电位反应值持续增加，在10.0 μg/μL时显著高于0.1 μg/μL的。从整体上看，雌虫对待测物质触角电位反应值显著高于雄虫。

3 讨论

目前关于小麦挥发物的研究多有报道，高筋小麦和低筋小麦在75 ℃下采用顶空固相微萃取和气质联用检出挥发性成分107种[20]，在80 ℃下小麦挥发物检测出46种[3]，在75 ℃下从5种小麦粉中测出挥发物共54种[21]，这些研究在样品处理上均为高温下顶空萃取挥发物质，高温下所得挥发物种类结果偏高。谷物的挥发物与样品处理温度有一定关系[22]，常温28 ℃下小麦挥发物只有11种[7]，本研究在常温28 ℃条件下检测出完整小麦、破碎小麦和全麦粉的挥发物种类分别为17、20、20种，进一步说明常温下小麦的挥发物种类数量为10～20种，且小麦破碎程度越高，其挥发物种类也会有所增加。常温条件下样品的挥发物较少，但常温更接近实际害虫发生的环境温度，此条件下利用顶空微萃取法进行取样和成分分析，结果对分析引诱害虫的谷物挥发物成分更有意义。

结合锈赤扁谷盗对储藏谷物感染的习性，破碎谷物较易于吸引其感染，不同破碎程度对害虫的引诱作用存在差异[23]。破碎的谷物对米象有较强吸引力，且不同程度的脱壳和破碎度对米象的吸引效果也不同[24]。本研究表明，小麦破碎度增加后不仅对害虫的引诱作用增强，而且相应的触角电位值也发生显著性变化，即破碎程度越高，对害虫的引诱效果越显著，触角电位反应也更明显，可能与其挥发物关系更密切。鉴于小麦破碎度高时更易于引诱害虫，小麦储藏中应尽量减少破碎粒率和不完善粒率。研究表明壬醛、戊醛、庚醛、己酸、1-辛烯-3-醇、异辛醇、3-辛酮等化合物对锈赤扁谷盗具有吸引作用[25-27]，不同破碎度小麦对锈赤扁谷盗表现出不同的引诱效果，可能与其中含有的特有成分有关，其中2, 4-二甲基-庚烷、3, 3-二甲基-己烷和反式-2-癸烯醛在完整小麦中未检出。不同谷物的挥发物在组成和含量上有所不同，从而形成其特定的气味，这些特定气味在昆虫选择寄主时具有重要行为导向作用。锈赤扁谷盗雌、雄成虫均对小麦中8种不同浓度挥发物产生不同程度的电生理反应，雌、雄成虫对待测挥发物的触角电位反应也存在差异，说明同一挥发物在不同性别害虫中可能行使的生理功能也各不相同。锈赤扁谷盗在取食选择过程中，其行为可能与这些挥发物有关，也可能与其协同效应有关，此类问题有待做进一步的研究。