不同前处理方法对山药中13种真菌毒素检测的影响

◎ 黎思乐，赵美平，容 顺，陈 维，梁达清，李词周，郭伟鹏

（1.广东省科学院微生物研究所，广东省微生物分析检测中心，华南应用微生物国家重点实验室，广东省微生物安全与健康重点实验室，广东 广州 510000；2.广州王老吉大健康产业有限公司，广东 广州 510000）

真菌广泛存在于空气、水、土壤等自然环境中，在环境条件适宜时，如温湿度过高，产毒真菌可大量繁殖。真菌产生的有害物质称为真菌毒素。常见的真菌毒素有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素、T-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、桔青霉素和杂色曲霉素，这些毒素的结构式及其危害具体见表1。

表1 真菌毒素结构式与危害表

山药，生活中最常见“药食同源”药材之一，富含淀粉、多糖、腺苷、环肽类和微量元素等多种营养成分，所以在栽培、采收、加工和分装运输过程中，如果存储条件不佳，容易受到各种产毒真菌及真菌毒素的污染。本文以山药为样品，通过优化前处理步骤，建立了高效、简洁的多种真菌毒素检测方法。

续表1

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

13种毒素标准品：黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2；赭曲霉毒素OTA；呕吐毒素DON；玉米赤霉烯酮F-2；T-2毒素；桔青霉素CIT；杂色曲霉毒素ST；伏马毒素FB1、FB2、FB3；均购自青岛普瑞邦生物工程有限公司。Pribolab试剂为甲醇、乙腈、甲酸，均为色谱纯，购自上海安谱公司。超纯水，实验室一级水，由Millipore超纯水机制备。

1.2 仪器与设备

UPLC-MS/MS超高效液相色谱-质谱仪，配电喷雾离子源：SCIEX Triple Quad 5500+；QT-1涡旋混合器：上海琪特分析仪器有限公司；多功能自动样品浓缩仪：Biotage；BSA224S-CW电子分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；KDC-40低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；EYELA旋转蒸发仪：上海爱朗仪器有限公司；氮吹仪：TurboVap。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

山药样品用粉碎机粉粹，称取山药样品2.5 g于50 mL离心管中，加入5 mL甲醇/水（80/20，V/V）-0.1%甲酸溶液，涡旋混匀1 min，超声20 min，在低速离心机以5 000 r·min-1离心5 min。上清液移去另一离心管，再加入5 mL乙腈/水（80/20，V/V）-0.1%甲酸溶液，重复前面步骤进行提取，合并2次上清液。取上清液5 mL，40 ℃水浴下，氮吹浓缩至近干，加入甲醇/水（50/50，V/V）定容2 mL，过0.22 μm有机滤膜，待测。

1.3.2 基质标准溶液配制

按1.3.1处理，获得空白样品液，根据后续实验稀释不同浓度。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：C18柱（Waters，1.6 μm×2.1 mm×100 mm）；流速：0.4 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样体积：5 μL，分析总时间10 min；流动相A：0.1%甲酸-0.5%乙酸铵，流动相B：甲醇；UPLC-MS/MS梯度洗脱条件：0～ 0.5 min，95%A，5%B；0.5～ 5 min，10%A，90%B；5.01～8 min，10%A，90%B；8.01～10 min，95%A，5%B。

1.3.4 质谱条件

质谱检测采用电喷雾离子源（ESI），检测模式为多反应检测（multiple reaction monitoring，MRM），13种真菌毒素质谱采集参数见表2，MRM色谱图见图1。

表2 13种真菌毒素的质谱采集参数表

图1 13种真菌毒素标准溶液-MRM谱图

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的优化

合适的提取溶剂不仅能减少样品中的杂质如脂肪和蛋白质等，降低基质效应，还可以提高回收率。样品提取一般采用有机溶剂加水作为溶剂，提取液含水可以湿润基质，增强有机溶剂的渗透能力[3]。不同毒素性质各有差异，如伏马毒素，它属于水溶性真菌毒素，在提取溶剂中加入一定比例的水，可有效地提取水溶性真菌毒素。

考察不同有机溶剂比例、酸碱度对13种真菌毒素的提取效果。第一组5种提取液和回收率见图2，当采用单一溶剂“甲醇/水”提取时，黄曲霉毒素回收率均小于65%，其他毒素采用甲醇/水时，回收率基本在60%～125%。当采用单一溶剂“乙腈/水”提取时，黄曲霉毒素回收率基本在60%～75%，其他毒素回收率均在70%～120%。所以两种有机溶剂中，乙腈/水的提取效果优于甲醇/水。而采用单一溶剂乙腈/水（80/20，V/V）提取和混合溶剂提取时，2种提取溶剂的回收率比较接近，虽都满足要求，但黄曲霉毒素回收率还是相对偏低。因黄曲霉毒素在中性或弱酸性溶液中稳定，第二组在提取液中加入0.1%甲酸，考察酸碱度对13种毒素提取效果和稳定性。第二组结果见图3，13种真菌毒素的回收率均略有提高，尤其回收率偏低的黄曲霉毒素。

图2 不同提取溶剂加标回收率对比图

图3 未加甲酸提取溶剂与加0.1%甲酸提取溶剂的回收率对比图

因此本实验选择混合溶液（第一次甲醇/水（80/20，V/V），0.1% 甲 酸； 第 二 次 乙 腈 /水（80/20，V/V）-0.1%甲酸）作为提取溶剂。

2.2 浓缩方式的优化

前处理过程中浓缩也可能存在损失，常见方法有旋蒸和氮吹，通过样品加标回收率考察各自的损失情况。结果如图4所示，通过氮吹方式浓缩的回收率明显高于旋蒸方式，所以前处理浓缩步骤优先选择氮吹方式。

图4 不同浓缩方式样品加标回收率对比图

2.3 基质效应

除前处理步骤，必须考虑另外一个影响因素——基质效应。基质效应是除分析物外的其他成分，其会对检测结果有影响，有增强或抑制作用[4]。样品中的基质如脂肪、蛋白质、色素对分析物测定有干扰，直接干扰分析物在检测器中的响应[5]。

基质效应（SSE,%）=空白基质标准溶液配制标准曲线的斜率/纯溶剂标准曲线的斜率×100[5]。该比值代表了干扰物对目标物离子化效率的影响。SSE为80%～120%为基质不明显；SSE＜80%为基质抑制效应；SSE＞120%为基质增强效应[6]。通过表3可知，山药中只有F-2、ST、T-2的SSE在80%～120%，所以基质效应不算明显；OTA、CIT、FB的都大于120%，对样品有增强效应；AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON的都＜65%，对样品有明显抑制效果。现在解决基质效应的方法主要有两个：使用合适的内标和采用基质标准溶液校正[6]。本实验通过配制基质校正曲线，用其定量样品，可以补偿其基质效应[7]。

表3 13种真菌毒素的信号抑制/增强效应表

2.4 方法学验证

2.4.1 标准曲线、检测限、定量限

13种真菌毒素响应值有差异，所以其线性范围有区别。按建立的样品预处理方法制备空白基质溶液，配制基质校正曲线，除CIT、FB、DON 3种真菌毒素外，其他毒素曲线浓度 0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1和 20 ng·mL-1，CIT 曲 线 浓 度1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和 100 ng·mL-1；FB 曲线浓度 0.5 ng·mL-1、1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1和 50 ng·mL-1；DON 曲线浓度 10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、150 ng·mL-1和 200 ng·mL-1。 按 1.3.4 和1.3.5色谱-质谱条件进样检测，以待测物色谱峰峰面积（Y）为纵坐标，进样浓度（X，ng·mL-1）为横坐标进行线性回归。标准曲线、检出限和定量限如表4所示，各种真菌毒素相关系数（R）均大于0.997，线性关系良好。

表4 13种真菌毒素的线性范围、检测限和定量限表

2.4.2 准确度和精密度

实验采用样品加标回收率方式检验其准确度和精密度。选取3个低、中、高加标浓度，添加标准品溶液到空白样品中，每个浓度进行3平行测定。按确定好实验方法进行测定，计算回收率和相对标准偏差（RSD）。准确度和精密度结果见表5，黄曲霉毒素在3个加标浓度的回收率在69.3%～85.6%，相对偏差RSD为0.6%～7.4%；其他12种加标浓度的回收率在70.1%～112.4%，相对偏差RSD为0.7%～7.2%，回收率良好，可满足山药中真菌毒素的检测要求。

表5 13种真菌毒素的方法回收率和RSD表

2.4.3 实际样品的检测

从广州市市区不同类型超市随机购买山药干10批次。通过建立的方法对10批山药进行13种真菌毒素检测，结果均小于食品标准的检出限，未检出。

3 结论

本文以山药为样品，经过优化提取溶剂、浓缩方式，最终实验确定提取溶剂为甲醇/水（80/20，V/V）-0.1%甲酸、乙腈/水（80/20，V/V）-0.1%甲酸混合提取液，氮吹方式进行浓缩。基质效应分析可知，部分真菌毒素在山药中有增强或抑制作用的基质效应，因此本实验选择用空白山药基质配制标准曲线，以此来补偿标准溶液和样品溶液中标物的响应。

经方法学验证，线性、准确度、精密度均符合实验要求，证明该方法前处理能快速实现13种真菌毒素测定。从广州市区不同类型的超市随机购买山药干10批次进行13种真菌毒素检测，均小于食品标准的检出限，结果均未检出。