气相色谱-三重四极杆串联质谱法测定茶叶中63种农药的多残留

◎ 陈 喆

（福建省南平市食品药品检验检测中心，福建 南平 353000）

茶叶作为一种富含有机酸、鞣质、色素、生物碱、多酚及嘌呤等复杂化学成分的植物原料，其多组分农药残留测定问题一直是业界难点，前处理费时、耗力、耗材、费用高、基质效应强等特点成为行业多农残分析的热点靶向基质。一般通过QuEchERS方法（ACAS方法/欧盟方法）、快速滤过净化管（m-PFC）[1]、传统TPT或GCB/NH2小柱法[2]、溶剂萃取法、GPC[3]等各种前处理技术的使用，或是双内标物法、保护剂双柱串联后反吹的仪器技术共同克服基质效应[4]。

本实验中，茶叶里的待测农药残留组分经乙腈-乙酸混合溶剂提取，采用QuEchERS净化方法，通过多反应监测模式（MRM）、基质标准工作曲线、内标法定量；优化了气相色谱-三重四极杆串联质谱（GC-MS/MS）的定量离子和定性离子，增加定性识别点个数，有效减少定性误判；同时对茶叶基质对多农药残留基质效应情况进行了研究。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

64种农药标准物质及内标物，购于Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、丙酮（色谱纯）；冰乙酸、无水乙酸钠（分析纯）；无水硫酸镁（分析纯，用前在500 ℃马弗炉内烘5 h，冷却后放入干燥器中备用）；PSA粉、C18粉、石墨化炭黑粉（GCB，购于岛津公司）。

气相色谱-三重四极杆串联质谱仪（TSQ8000 Evo，美国赛默飞世尔公司）；高速离心机（美国Sigma公司）；IKA Tl8均质器（德国IKA公司）；多功能全自动样品浓缩仪（Biotage）。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

分别准确称取适量的农药标准品，用丙酮溶解并定容，配制成1 000 mg·L-1的63种单一农药标准储备液和内标储备液（内环氧七氯）；移取适量农药标准储备溶液至容量瓶中，用丙酮-正己烷（1∶1，V/V）稀释并定容，配制成10 mg·L-1的农药混合标准储备液；移取适量内标储备溶液至容量瓶中，用丙酮-正己烷（1∶1，V/V）稀释并定容，配制成10 mg·L-1的内标储备液；农药标准溶液均贮存于（-18±1）℃冰箱中。

1.2.2 样品处理

称取2 g试样（精确至0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加10 mL水涡旋混匀，静置30 min。加入15 mL乙腈-醋酸溶液（99∶1，V/V）、6 g无水硫酸镁、1.5 g醋酸钠及1颗陶瓷均质子，盖上离心管盖，剧烈振荡1 min后在6 000 r·min-1离心5 min。吸取8 mL上清液加到内含1 200 mg硫酸镁、400 mg PSA、400 mg C18及200 mg GCB的15 mL塑料离心管中，涡旋混匀1 min。6 000 r·min-1离心5 min，准确吸取2 mL上清液于10 mL试管中，40 ℃水浴中氮气吹至近干。加入20 μL的内标溶液，加入1 mL丙酮-正己烷（1∶1，V/V）复溶，过微孔滤膜，用于测定。

1.3 气相色谱-质谱联用分析条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Pesticides II with 5 m guard石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国赛默飞公司）；柱温：40 ℃；程序升温过程：40 ℃保持1.5 min，以25 ℃·min-1程序升温至90 ℃，再以25 ℃·min-1升温至90 ℃，保持1.5 min， 再 以 25 ℃·min-1， 升 温 至 180 ℃； 再 以5 ℃·min-1升 温 至 280 ℃， 再 保 持 1.5 min； 再 以10 ℃·min-1，升温至300 ℃，保持5 min。载气：氦气，碰撞气：氮气，纯度均≥99.999%，载气流速1.2 mL·min-1；进样口温度：270 ℃；进样量：1 μL；进样方式：不分流进样。

1.3.2 质谱条件

EI电压：70 eV；离子源温度：300 ℃；传输线温度：280 ℃；数据采集方式：多反应监测（MRM）；溶剂延迟：5 min，63种农药成分的保留时间及优化的MRM参数见表1。

表1 63种农药成分的保留时间及优化的MRM参数表

续表1

续表1

2 结果与分析

2.1 线性范围、线性方程

精确吸取一定量的混合标准溶液，逐级用丙酮-正己烷（1∶ 1，V/V）释成质量浓度为 5 μg·L-1、10 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1和 500 μg·L-1的标准工作溶液。空白基质溶液氮气吹干，加入20 μL内标溶液，分别加入1 mL上述标准工作溶液复溶，过微孔滤膜配制成系列基质混合标准工作溶液，供气相色谱-质谱联用仪测定。以农药定量离子峰面积和内标物定量离子峰面积的比值为纵坐标，农药标准溶液质量浓度和内标物质量浓度的比值为横坐标，绘制标准曲线，在5.0～500.0 μg·L-1的浓度范围内，各目标组分在茶叶基质响应值比率与含量呈现良好的线性关系，相关系数（R2）均大于0.99，具体结果见表2。

表2 茶叶-基质标准溶液回归方程、相关系数表

2.2 回收率、精密度、检出限

2.2.1 样品加标回收率和精密度

按1.2样品处理和实验条件，取茶叶样品（绿茶、红茶、乌龙茶），做3个浓度水平（分别为50 mg·kg-1、250 mg·kg-1、500 mg·kg-1）的标准加入回收实验，称取样品后分别加入混合标准溶液，每个浓度添加水平均按本方法做6次平行测定，结果各农残目标组分回收率为66.1%～126.1%，相对标准偏差（RSD）为1.7%～16.6%，详见表3。

表3 茶叶样品（加标样品）中64种农药残留回收率、精密度表（n=6）

续表3

2.2.2 检出限范围情况

本次研究以绿茶作为茶叶基质代表，以S/N=3计算检出限（LOD）。从图1可以看出，63种农药残留目标分析物中有52种检出限低于0.01 mg·kg-1，其中检出限低于0.001 mg·kg-1的有 14种，检出限为 0.001～ 0.005 mg·kg-1的有17种，检出限为0.005～0.01 mg·kg-1的有20种；检出限为0.01～0.05 mg·kg-1的有10种，仅有2种目标分析物检出限大于0.05 mg·kg-1。

图1 茶叶基质中63种农药残留目标分析物的检出限范围图

2.3 定性能力

按照欧盟方法学标准[5]，质谱方法定性确证必须达到最少4个识别点要求，定性点越多定性越准确，反之则容易出现假阳性结果。对于低分辨质谱，MRM监测模式下，至少选择2个离子对进行定性确认，一对离子计为2～2.5个定性点。若是1个母离子加上2个子离子则识别点为4，若是2个母离子，且每个有1个子离子则识别点为5。

因此本实验中，选择1个定量离子对和2个定性离子对，且有34种农残目标物MRM选择离子对的母离子都不同，按照计算可以得到农药残留目标物的识别点达到7.5个，极大地保证了定性的准确性。对茶叶这一类基质效应影响较大、基质干扰物（如氨基酸、色素、鞣制等）比较复杂的样品，可以有效解决前处理也可能无法消除的定性误判问题。

图2（A）为250 mg·L-1硫丹标准溶液3个检测离子的MRM色谱峰相对离子强度比较图，图2（B）为250 mg·L-1硫丹（茶叶基质）溶液3个检测离子MRM色谱峰相对离子强度比较图。从图2（A）可以看到离子对194.9→125的检测离子125（b）与离子对194.9→159的检测离子159（a）的相对离子强度比为80.41%，而图2（B）可以看到离子对194.9→159的检测离子159（a）有比较大的离子干扰，造成检测离子159的色谱峰展宽拖尾严重，检测离子125与检测离子159的相对离子强度比为0.83%，不符合“检测离子的相对离子强度比＞50%、相对离子强度应在±20%”的要求，误判为阴性；而舍去离子对194.9→159的检测离子159（a），使用选择离子对194.9→125的检测离子125（b），选择离子对240.6→205.9的检测离子205.9（c），有两个母离子且每个都有1个子离子，定性识别点有5个，仍可满足定性确证必须达到确认需要最少4个识别点要求，仍旧可将样品判出阳性检出。

图2 硫丹3个检测离子的MRM色谱峰相对离子强度比较图

与常规方法比较，每个化合物多选择一对定性离子对，当另外一对定性离子对受到通过前处理也无法消除的基质干扰时，仍旧不影响定性判定，在实际工作中灵活性强、便捷性高、应用范围更广，克服基质带来的干扰更加有效。

2.4 基质效应对比

色谱分析中，由于样品基质成分的存在，减少了色谱系统活性位点与目标分子作用的机会，使得目标分析物响应比纯溶剂中的色谱响应高，出现基质效应增强的效果。基质效应的相对强度（Matrix Effect，ME）=（基质标准溶液的峰面积比值/溶剂标准溶液的峰面积比值）×100%。将绿茶、红茶、乌龙茶、苹果和大米空白基质按样品方法进行处理，氮气吹干，加入20 μL内标溶液，分别加入1 mL上述50 mg·L-1标准工作溶液复溶，过微孔滤膜配制成各种基质混合标准溶液，供气相色谱-质谱联用仪测定，得到定量离子峰面积与内标溶液之比值，与纯溶剂50 mg·L-1标准溶液的对应目标物比值，按上述公式进行计算，可得农残目标物的基质效应的相对强度。

从图3可知，同一目标物在不同基质中所受的基质效应的大小各有不同，其中茶叶与其他植物源基质的基质效应比较而言尤为不同。其他植物源基质如苹果对于有些农药残留目标分析物存在基质效应减弱的情况（ME小于100%），ME小于150%占到了1/3；而对于茶叶来说，不论绿茶、红茶、乌龙茶都不存在目标分析物基质效应减弱的情况，64种农药残留分析基质效应影响超过600%占了1/2以上，而基质效应影响小于150%低于3%，说明茶叶基质对农药残留分析的影响更为复杂，目标分析物基质效应呈现强增强效应，必须使用基质加标曲线才能最大程度减小由于基质效应带来的测定不准确性。

图3 不同基质效应比较图

通过3种茶叶对相应目标物基质效应的对比也可以发现，不同茶叶之间基质效应增强的情况比较一致，定量分析时使用一种茶叶基质作为基质加标曲线，即可有效克服基质效应，这也有利于日常开展茶叶农药残留的分析，减少工作的烦琐程度。

2.5 实际样品检测

用所建立的方法对市售的3种茶叶（红茶、绿茶、乌龙茶）共30例样品进行测定，共有10批检测出阳性目标物，其中绿茶和红茶样品农药的检出率较高，检出频率较高的农药为毒死蜱、氟虫腈、硫丹、联苯菊酯、氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯，但均未超过最大残留限量。

3 结论

本文建立了对茶叶中64种农药残留进行的QuEChERS-GC/MS/MS方法。该方法准确性和重复性好、操作简便，适用茶叶类等复杂基质的多种农药残留的同时测定。优化了气相色谱-三重四极杆串联质谱（GC-MS/MS）的定量离子和定性离子，增加定性识别点个数，有效减少定性误判和克服离子干扰，研究了茶叶基质对多农药残留基质效应情况，为茶叶多农残分析研究提供了可靠的检验方法。