水酶法提取黄刺玫籽油的工艺条件优化

◎ 殷春燕，谢广明，韩博洋，张献忠，李 丹，董占军

（1.邯郸学院 生命科学与工程学院，河北 邯郸 056005；2.河北美临多维粮油贸易有限公司，河北 邯郸 056600）

黄刺玫（Rosa xanthinaLindl）属蔷薇科蔷薇属野生落叶灌木，晋南地区民间将其称为马茹子，广泛分布于南太行山区[1-2]。研究表明，黄刺玫果实营养丰富，含有维生素、黄酮、芦丁等物质，具有调节人体机能、抗氧化等功能[3]。黄刺梅果质量的50%～60%为黄刺玫籽，其中黄刺玫籽中含脂肪11%左右。黄刺玫籽油中富含维生素E、维生素A等多种微量元素和不饱和脂肪酸（约94%）[4]，其中亚油酸和亚麻酸的含量分别为53.88%、24.06%，因此黄刺玫籽油可作为一种新兴油脂产品，具有广阔的发展前景。

黄刺玫鲜果资源十分丰富，每667 m2产量为60～80 kg[2]，因相关研究较少，对其开发利用不足，导致大量的黄刺玫籽被白白浪费，因此有效利用黄刺玫籽，建立一种绿色高效的黄刺玫籽油提取方法显得尤为重要。目前，植物油的提取方法主要包括压榨法、溶剂萃取法、超声辅助法、水酶法以及超临界CO2萃取法等[5-8]。其中水酶法因反应条件温和、无溶剂残留、对环境友好等优点被广泛用于胡麻籽油[9]、牡丹籽油[10]、山核桃油[11]等植物油脂的提取。黄刺玫籽油作为一种新兴油脂产品，相关研究还较少，目前只有溶剂萃取法[12]和超临界CO2萃取法[4]被用于黄刺玫籽油的提取，水酶法在黄刺玫籽油提取中的应用在国内外还没有相关报道。因此，本文以水酶法作为提取方法，采用单因素实验分析5个因素（酶的种类、料液比、酶解时间、pH及酶添加量）对黄刺玫籽油提取率的影响，并在单因素基础上选出影响较大的因素，利用响应面Box-Behnken设计建立模型，对黄刺玫籽油提取工艺条件进行优化，确定水酶法提取黄刺玫籽油的最佳工艺，以便为黄刺玫籽油的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄刺玫籽，市售；纤维素酶（≥30 000 U·g-1）、碱性蛋白酶（≥30 000 U·g-1）、中性蛋白酶（≥200 000 U·g-1）、半纤维素酶（≥2 000 U·g-1）、果胶酶（≥30 000 U·g-1），合肥博美生物有限公司。

1.2 仪器与设备

YS-08高速粉碎机，北京燕山正德机械设备有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵，郑州长城科贸有限公司；N-1100旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；80-2型台式电动离心机，国华电器有限公司；GRX-200电热恒温鼓风干燥箱，西安禾普生物科技有限公司；2004-21（61）超级恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；FA2104N电子天平，上海精密科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 黄刺玫籽油的提取

选择正常并经自然干燥，无霉烂的黄刺玫籽，置于60 ℃烘箱中，烘干30 min。将黄刺玫籽用万能粉碎机进行粉碎，过筛（60目），备用。

准确称取一定质量的黄刺玫籽粉末，加入蒸馏水（料液比1∶8）作为分散相，用0.1 mol·L-1的HCl 和0.1 mol·L-1的NaOH调节pH，加酶，混匀，酶解5 h后，95 ℃保温10 min灭酶，将酶解液在5 000 r·min-1的条件下离心20 min，取上清液即为黄刺玫籽油。对得到的黄刺玫籽油进行称重，按式（1）计算提取率[13]。

式中：m1-黄刺玫籽油质量，g；m0-黄刺玫粉的质量，g。

1.3.2 单因素试验

针对黄刺玫籽酶解过程中涉及的5个主要酶解条件进行单因素试验，各个条件梯度设置如表1所示。

表1 单因素试验设计表

1.3.3 响应面实验设计

在单因素实验基础上，选取对提取率影响较大的3个因素，利用响应面Box-Behnken设计，以黄刺玫籽油提取率y为响应值，优化水酶法提取黄刺玫籽油的工艺。

1.4 数据处理

所有实验数据均做3次平行实验，使用SPSS 20.0对数据进行方差分析，结果以均值±标准差表示。采用Origin8.0绘图，响应面实验设计及分析采用Design Expert8.0。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 酶的种类

酶的种类显著影响植物油脂的提取率。LIU Z等[14]采用超声辅助水酶法提取无患子种仁中油脂时，发现中性蛋白酶（65.23%±1.45%）和纤维素酶（60.95%±1.45%）的提取效果最佳，果胶酶（42.52%±0.97%）和α-葡聚糖酶（38.91%±0.89%）的提取率较低。杨瑞[15]研究发现碱性蛋白酶比中性蛋白酶、纤维素酶更适用于奇亚籽油的提取。

在各酶最适温度和pH下，分别考察果胶酶（50 ℃，pH4.0）、中性蛋白酶（45 ℃，pH7.5）、纤维素酶（50 ℃，pH4.5）、碱性蛋白酶（45 ℃，pH10）和半纤维素酶（50 ℃，pH5.0）对黄刺玫籽油提取率的影响，结果如图1所示。由图1可知，单类酶中，纤维素酶（6.43%±0.09%）和中性蛋白酶（6.32%±0.08%）的提取率最高且两者没有显著差异，其次为果胶酶（6.10%±0.10%）和碱性蛋白酶（5.92%±0.16%），半纤维素酶（5.41%±0.08%）的提取率最低。相关研究表明，复合酶可以产生协同作用，增加油脂的提取率[14,16]，故在50 ℃，pH6.0条件下测定复合酶（纤维素酶∶中性蛋白酶=1∶1）的提取率。结果发现，复合酶的提取率显著高于单一酶，故在后续研究中，选用纤维素酶和中性蛋白酶按照1∶1的比例进行黄刺玫籽油的提取。

图1 酶的种类对黄刺玫籽油提取率的影响图

2.1.2 料液比

不同料液比下，黄刺玫籽油的提取率变化情况如图2所示。由图2知，料液比＜1∶8时，溶剂比例越大，黄刺玫籽油的提取率越高。当料液比＞1∶8时，提取率开始呈现降低趋势。可能由于料液比的增大，导致酶与底物浓度的降低，从而引起酶解效率下降[17]，因此在后续提取过程中选择料液比为1∶8。

图2 料液比对黄刺玫籽油提取率的影响图

2.1.3 酶解时间

不同的酶解时间时黄刺玫籽油的提取率变化情况如图3所示。随着酶解时间从2 h增加至5 h，黄刺玫籽油的提取率由2.35%±0.10%增加至6.63%±0.09%。酶解时间大于5 h后，提取率不再发生明显变化（p＜0.05）。综合提取率和时间成本来看，水酶法提取黄刺玫籽油的最佳酶解时间为5 h。

图3 酶解时间对黄刺玫籽油提取率的影响图

2.1.4 pH

在不同pH下，黄刺玫籽油的提取率变化情况如图4所示。随着pH由4.0增加至6.0，黄刺玫籽油的提取率从4.11%±0.12%增加至最大值6.63%±0.09%，当pH由6.0继续增加时，提取率开始下降。在pH为8.0时，提取率比pH为6.0时下降了33.18%。在适宜的pH下，酶才能发挥活性[9]。纤维素酶和中性蛋白酶的最适pH不同，分别为4.5和7.5。在提取过程中，pH偏高或偏低都会影响两种酶的活力，结果表明在pH为6.0时两种酶的综合活力达到最大，因此所用复合酶的最适pH为6.0。

图4 pH对黄刺玫籽油提取率的影响图

2.1.5 酶添加量

不同酶添加量时黄刺玫籽油的提取率变化情况如图5所示。在酶添加量为1%～3%，随着酶添加量的增加，黄刺玫籽油的提取率由5.25%±0.08%增加至6.85%±0.09%，当添加量到达3%时，黄刺玫籽油的提取率达到最高。酶添加量为3%和4%时的提取率没有显著差异，但当酶添加量超过4%时，提取率开始下降。吕秋冰等[18]利用葡聚糖酶提取冬瓜籽油以及杨瑞[15]用碱性蛋白酶提取奇亚籽油时也得到同样的结果。可能由于酶添加量过大，使得酶的活性部位不能充分暴露，减少了酶与黄刺玫籽粉末的接触机会，酶作用受到限制[17-18]，因此复合酶最佳添加量为3%。

图5 酶添加量对黄刺玫籽油提取率的影响图

2.2 响应面优化实验

2.2.1 响应面模型的建立

在单因素实验基础上，固定条件为酶解温度50 ℃、料液比1∶8、复合酶（纤维素酶∶中性蛋白酶）比1∶1，选择酶解时间、pH、酶添加量3个因素进行Box-Behnken响应面实验设计，对提取工艺条件进行优化。响应面试验因素水平如表2所示，响应面试验设计及结果如表3所示。

表2 响应面试验因素水平表

表3 响应面试验设计与结果表

对表3中实验结果进行多元回归拟合，模型为：提取率y=-47.249 5+2.753 8A+14.640 5B+1.140 2C-0.017 5AB+0.020 0AC+0.057 5BC-0.259 0A²-1.191 5B²-0.254 0C²。方差分析具体情况如表4所示。

表4 方差分析表

由方差分析结果可知，模型p＜0.000 1，失拟项p=0.117 4＞0.05，说明模型具有极高的显著性。决定系数R2=0.996 5，校正决定系数R2=0.992 0，预测R2=0.957 1，说明模型适用于预测不同反应条件下黄刺玫籽油的提取率。所选择的3个因素都显著影响黄刺玫籽油的提取率（p＜0.05），且影响大小依次为B（pH）＞A（酶解时间）＞C（加酶量）。此外，模型中二次项A2、B2、C2对黄刺玫籽油提取率的影响极显著（p＜0.000 1），AB、AC、BC对提取率没有显著影响（p＞0.05），说明因素间没有交互作用。

2.2.2 各因素交互作用的响应面图

不同因素交互作用对黄刺玫籽油提取率影响的响应面图如图6所示。响应面图能够直观反映因素水平改变时提取率的变化情况，响应曲面越陡峭说明该因素水平变化时，提取率的变化越大，因素对提取率的影响越显著[19-20]。

图6 不同因素对黄刺玫籽油提取率影响的响应面图

从图6中可以看出，所有的响应曲面均存在最高峰，说明在所选择的因素水平范围内存在最大值，所选择的因素水平合理[21]。图6（a）为固定酶添加量在0水平（3%）时，提取率随酶解时间和pH改变时的变化情况。当酶添加量不变时，随着酶解时间和pH的增加，提取率都呈现先增加后降低的趋势。与酶解时间相比，pH改变时提取率的响应曲面更陡峭。图6（b）为pH固定在0水平（pH6.0）时，提取率随酶添加量和酶解时间改变时的变化情况。当酶添加量为3%、酶解时间为5 h时提取率达到峰值，酶添加量和酶解时间的继续增加不会引起提取率的升高，反而导致提取率下降。酶解时间对提取率的响应曲面更陡峭。图6（c）为固定酶解时间0水平（5 h）时，提取率随酶添加量和pH改变时的变化情况。与上述结果类似，当pH不变时，提取率随酶添加量的增加，呈现先上升后降低的趋势，在酶添加量为3%时，提取率达到最大值。同样，当酶添加量不变时，提取率随pH变化的趋势类似随酶添加量的变化。与酶添加量相比，pH对提取率的响应曲面更陡峭，说明pH的影响更显著。这与表4中方差分析的结果相吻合。

2.2.3 验证实验结果分析

由回归方程求得黄刺玫籽油提取的最优工艺为：酶解时间5 h、酶添加量3.20%、pH6.17，在此工艺条件下，提取率预测为6.94%。并做3组平行实验作为验证实验。考虑实际实验条件，将工艺条件调整为酶解时间5 h、酶添加量3.20%、pH6.2，得到提取率为7.05%±0.12%，与预测值相差1.56%，可信度较高，表明回归模型可以对不同因素条件下黄刺玫籽油的提取率进行预测。

3 结论

本文利用水酶法对黄刺玫籽中的油脂进行提取，采用单因素实验和响应面实验探讨不同的酶解条件对黄刺玫籽油提取率的影响，并确定水酶法提取黄刺玫籽油的最佳工艺。最佳工艺条件为固定料液比为1∶8、酶解温度50 ℃、复合酶（纤维素酶∶中性蛋白酶）比1∶1、酶解时间5 h、pH6.2以及酶添加量3.20%，在此条件下，提取率为7.05%±0.12%，与预测值相差1.56%，表明回归模型可以较好地预测不同因素条件下黄刺玫籽油的提取率。方差分析结果表明，所选择的3个因素都显著影响黄刺玫籽油的提取率（p＜0.05），且影响大小依次为pH＞酶解时间＞加酶量。