怀菊不同部位内生细菌多样性分析

田存章贺新平万嘉欣姬国杰周红伟崔靖吴文龙

(1.新乡医学院三全学院生物与基础医学实验教学中心，河南 新乡 453003；2.新乡医学院三全学院生命科学技术学院，河南 新乡 453003)

菊花是菊科植物菊的干燥头状花序，怀菊花作为河南4大怀药之一，其气清香，味甘、苦，具有清热解毒、清肝明目等功效[1]，具有极高的应用价值。现代药理研究表明，菊花具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、降血脂等药理活性[2]。

植物内生菌指某些微生物在其生活史的一定阶段或全部阶段寄生于健康植物体内、又不引起宿主植物明显病害症状的微生物，其与宿主存在着和谐共生关系[3]。内生菌普遍存在于植物的各种组织、器官及细胞间隙当中，具有丰富的生物多样性，是植物微生态系统的重要组成部分。内生菌包括内生细菌、放线菌和真菌。近年来，植物内生细菌作为重要的微生物资源，其可能参与植物的生理活动和代谢，给植物带来新的变化和功能，很多研究表明,药用植物的内生细菌可以产生与宿主相同或相似的活性物质，其代谢产物具有抗菌、降血压、保护心血管等多种药理作用。张国荣等人研究报道,药用植物川芎可分离出产生川芎嗪的5株枯草芽孢杆菌，其产物川芎嗪具有改善微循环、保护心血管、防止血栓形成等多种药理作用[4]。李玲玲采用琼脂块法和双层平板法对从药用植物青蒿中分离的内生细菌的抑菌活性进行研究，发现19株内生细菌中有18株具有抑菌活性，抑菌活性菌株的比例最高，达到了95%[5]。鞠鑫等从人参中分离得到内生假单胞菌G13476，通过MTT、Western Blot实验发现，菌株G13476次级代谢产物可下调Bcl-2、上调Bax，实现对乳腺癌的抑制作用[6]。

高通量测序技术是目前研究微生物的群落及种类信息的常用技术手段，具有信息量大、可靠性高、可重复性好等优点，李秋桦等应用高通量测序技术对7种不同品种的梨内生细菌多样性进行研究分析，为进一步研究梨与内生细菌间的互作关系奠定了一定基础[7]；刘蓬蓬等基于Illumina MiSeq高通量测序技术对黄芪内生细菌的16S rDNA的区域序列进行分析，从而确定了黄芪内生细菌的优势菌群和菌群生物多样性[8]。目前，关于植物内生细菌的研究报告很多，但有关药用菊花怀菊内生细菌的研究报道相对较少，本研究以药用怀菊为试验材料，基于高通量测序技术对怀菊不同部位内生细菌分布及群落特征进行初步分析，以期为怀菊花内生细菌资源的合理开发应用提供依据。本研究为怀菊内生菌资源的进一步研究与开发应用提供了一定的理论数据。

1 材料与方法

1.1 材料

怀菊，于2020年11月采自河南省新乡市武陟县。

1.2 试剂与仪器

基因组提取试剂盒，OMEGA公司；Qubit3.0 DNA检测试剂盒，Thermo Fisher Scientific公司；Pico-21台式离心机，Thermo Fisher公司；DYY-6C电泳仪，北京市六一仪器厂；FR-1000凝胶成像系统，上海复日科技有限公司；Qubit®3.0荧光计，Invitrogen公司；ETC 811PCR仪，北京东胜创新生物科技有限公司。

1.3 样品材料表面消毒

选择生长良好怀菊，采样后用水冲洗干净，吸取水分后，将其部分茎、叶、花材料置于超净工作台中紫外灯照射20min，之后用10%的次氯酸钠溶液浸泡处理5min，无菌水冲洗3～6次，用无菌滤纸吸取多余水分，备用。

1.4 消毒可靠性检测

1.4.1 漂洗液培养

用最后一次冲洗消毒后试验材料的无菌水涂布平板，37℃条件下培养24h后，观察培养结果，以检测表面消毒的可靠性。

1.4.2 组织印迹检测

参考李玲玲等实验方法[3]，用无菌镊子夹住已消毒处理过的供试植物材料，使其消毒表面与相应固体培养基充分接触3～5min后取出，于适当条件下培养24h，以检测表面消毒的可靠性。

1.5 内生细菌的多样性检测

1.5.1 样品总DNA的提取

分别取适量怀菊茎、叶、花样品于2mL无菌离心管中，经破碎仪破碎后，参照OMEGA试剂盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取试剂盒方法提取基因组DNA。采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，并使用Qubit3.0 DNA检测试剂盒对DNA进行精确定量。

1.5.2 PCR扩增及其测序

以提取的总DNA为模板对细菌16S rDNA的V3-V4区域序列进行PCR扩增，PCR扩增参照张双虹等两轮PCR扩增方法[9]。高通量测序由生工生物工程股份有限公司基于Illumina MiseqTM/HiseqTM高通量测序平台完成。

1.5.3 数据处理

将得到的测序序列，使用Cutadapt软件去除引物接头序列，使用PEAR软件对测序序列进行拼接，根据样本中标签序列和引物序列从拼接数据中分割出各样本数据，并使用PRINSEQ切除部分低质量值序列，过滤掉低复杂度的序列，最终得到有效测序数据。使用Usearch软件对个样本优化序列按照97%相似水平上进行OTU聚类；再对OTUs进行丰度、Alpha多样性指数等进行分析，探索怀菊内生菌的种群分布特征及多样性。测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2 结果分析

2.1 怀菊材料消毒可靠性检测

怀菊试验材料消毒后最后一次漂洗液培养和组织印记培养，结果表明,培养基中均无微生物菌落长出，表明试验材料消毒灭菌可靠。

2.2 怀菊不同部位内生细菌测序有效序列长度分布

怀菊茎、叶、花不同部位高通量测序得到的原始序列质控后得到V3-V4区域的有效序列数在63797～77327条，有效序列合计为215632条，长度在357～474bp，平均长度为407bp，菊花茎、叶、花测序质控后得到有效序列分别为77327、74508和63797条，见表1。

表1 有效序列数据统计

2.3 怀菊不同部位内生细菌OUT、多样性分析

按照97%相似度对序列进行OTU聚类，一个OUT的序列被认为可能是来自于同一个种属的序列，怀菊有效序列共聚成57个OTUs，排除未分类细菌类型后，分属10个细菌门、17个细菌纲、23个细菌目、27个细菌科和25个细菌属。由表2可知，菊花茎、叶、花分布聚成54、54和51个OTUs。所有样品的OTU覆盖度均大于99.9%，说明样品的覆盖度很广，测序结果可反映样品中内生细菌群落组成的真实情况。去除未分类细菌类型后，怀菊茎聚成的可分类OUT序列分属10个细菌门、16个细菌纲、23个细菌目、27个细菌科和25个细菌属，怀菊叶聚成的可分类OUT序列分属10个细菌门、16个细菌纲、22个细菌目、26个细菌科和23个细菌属，怀菊花聚成的可分类OUT序列分属10个细菌门、16个细菌纲、22个细菌目、25个细菌科和22个细菌属，说明怀菊不同部位的内生细菌在分类阶元在数量上存在差异。

由表2可知，结合菊花不同部位内生细菌的多样性指数中的Shannon、Simpson、Chao和Ace指数分别在0.30～0.62、0.67～0.88、51.75～54.75和52.02～55.17；说明怀菊不同部位内生细菌多样性指数存在一定的差异。综合分析4个多样性指数，显示菊花花中内生细菌多样性较高，叶中多样性最低，而茎中的群落丰富度较高，花中的群落丰富度最低。在属水平上，菊花不同部位的内生细菌的优势菌均为Streptophyta属，其在菊花茎、叶、花中占比分别为87.21%、93.85%和79.93%，另外，分别有2个菌属为怀菊茎、叶所特有，Capnocytophaga和Asticcacaulis菌属为怀菊茎特有菌，2个未分类菌属为怀菊叶所特有。研究结果表明，菊花不同部位内生细菌的菌群结构存在一定差异。

表2 内生细菌Alpha多样性

3 结论

本试验以怀菊为研究材料，利用高通量测序技术对怀菊不同部位内生细菌的组成及分布特征进行研究，发现怀菊不同部位的内生细菌在某些分类阶元在数量上存在差异。通过对怀菊不同部位内生细菌的多样性指数进行分析，表明菊花不同部位内生细菌多样性指数存在一定的差异，显示菊花花中内生细菌多样性较高，茎次之，而叶最低。菊花不同部位的内生细菌的优势菌均为Streptophyta属，Capnocytophaga和Asticcacaulis菌属为怀菊茎特有菌，2个未分类菌属为怀菊叶所特有，说明菊花不同部位内生细菌的菌群结构存在一定差异。