不同填料性质对SMX 去除率的影响及微生物的响应特征

张启文 杨红薇 董晓明 罗景诚 江禹友

（西南交通大学地球科学与环境学院，四川成都 610031）

1 引言

近年来，随着抗生素的大规模生产和持续使用，大量抗生素进入地表水和地下水体中，造成抗生素抗性基因和耐药细菌的传播，极大威胁着人类健康［1-2］。其中，磺胺甲 唑（Sulfamethoxazole，SMX）因具有复杂的分子结构和特殊的化学性质，在传统的二级污水处理中难以高效去除［3］，是世界范围内各城镇二级污水处理厂出水中检出频率最高的抗生素［4-8］。城镇污水处理厂作为抗生素进入自然水体中重要的防线之一，对防治抗生素进一步污染水环境具有重要作用，提高现有污水处理系统对抗生素的处理效率势在必行。

人工快速渗滤系统（Constructed Rapid Infiltration System，CRI 系统）在河道微污染水净化、二级生物处理出水深度净化、分散农村生活污水处理等方面得到了广泛的应用［9-11］。其中，渗滤系统中填料是核心，它既是吸附阻截污染物的主体，也是微生物附着生长的载体。针对传统的土壤渗滤系统，秦可娜通过添加粉煤灰使系统对SMX 的去除率由72.04%提高到79.16%，对红霉素的去除率由64.41%提高到68.11%［12］；刘芹芹采用陶粒混合粉质黏土、粗砂构建模拟柱使甲氧苄啶和SMX 的去除效率分别达到80%～90%和60%～70%［13］，证实了强化填料吸附性能改良系统功能的可行性。然而，填料吸附性增强带来的去除效率提高持久性及对微生物附着生长的影响不甚明确。日本的He 等人模拟花岗岩土、石英砂等3 种填料渗滤系统对27 种微量药物和个人护理品（PPCPs）的去除，结果表明，填料吸附的增强强化了系统运行效率，但对生物降解效果没有影响［14］。因此，有必要针对渗滤填料吸附性与系统去除新兴污染物的效果、系统微生物的响应状况开展研究，以便于进一步明确渗滤系统净化新兴污染物的机理，为CRI 系统的进一步改进奠定基础。

本文选取河沙、蛭石、火山岩和活性炭作为渗滤填料，构建了室内模拟系统，持续运行1 年左右。在了解CRI 系统对SMX 去除效果的基础上，分别从填料种类和填料粒径探究了其对CRI 系统去除SMX的影响机制及微生物的响应特征，为CRI 系统填料的优化和工程运行改进提供参考。

2 试验材料与方法

2.1 填料

本试验筛选了粗河沙、细河沙、蛭石、火山岩及活性炭作为备选填料，各填料的理化性质见表1。填料经自来水冲洗去除杂质后，在100～103 ℃烘干放至常温，称取适量填料装入模拟柱中，填料高度为40 cm。

表1 填料性质及装填参数

2.2 CRI 模拟试验

2.2.1 模拟柱的构建

柱体试验装置如图1 所示。试验柱体为内径5 cm、高50 cm 透明有机玻璃柱。为避免柱体内SMX 的光解，在柱体外表包裹锡纸。试验从柱体顶端进水，以重力流方式从底端出水。

图1 试验模拟柱装置示意

2.2.2 微生物接种及模拟柱的运行

系统正式运行前以猪粪水菌悬液和模拟废水配制的接种液进行微生物接种。待系统氨氮去除率基本稳定后，在进水中添加抗生素开展试验。以每天2个周期，水力负荷1.0 m3（/m2·d）运行；每周期进水10 min 后打开出水阀，收集周期内出水水样，混匀后取1.5 mL 过0.22 μm 滤膜于棕色取样瓶中，4 ℃保存待测。系统运行分成4 个阶段，具体情况见表2。

表2 模拟柱4 个阶段运行的相关参数

2.2.3 试验水质

试验用水为含30～140 μg/L SMX 的人工模拟城镇二级污水处理厂出水，配方见表3。

表3 人工模拟城镇二级污水处理厂出水配方 mg/L

2.2.4 填料微生物采样

系统运行稳定后，在模拟柱运行后期对附着于填料上的微生物开展了采样。取各系统表层以下5 cm左右的土壤样品各0.5 g，混匀后装入经121 ℃高压灭菌的离心管中，存放于－20 ℃冰箱用于DNA 提取。

2.3 动态吸附批量试验

按照2.2.1 的方法装填完成后，在水力负荷为1.0 m3/（m2·d）条件下开展吸附试验。进水分6 次完成，每批出水水样单独收集，混匀后取样1.5 mL 存于棕色试剂瓶中，于4 ℃冰箱存放待测。

2.4 试验药品及仪器

药品及试剂：SMX（色谱纯，上海罗恩试剂厂）；K2HPO4、可溶性淀粉、NaHCO3、NH4Cl、葡萄糖、Mg－SO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）；甲醇、冰乙酸（色谱纯，成都市科龙化工试剂厂）。

试验仪器：高效液相色谱仪配紫外检测器（Waters2695）；色谱柱（Symmetry C18，型号4.6 mm×150 mm）；电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司，FA224）；电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司，101－3AB 型）；超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）。

2.5 测试指标及检测方法

pH 采用pH－10 笔式酸度计测试，水温和电导率使用STARTER 3100c 电导率仪同时测定，氨氮采用UV－4802H 紫外分光光度计测定，测试方法为纳式试剂法。

SMX 采用Waters 高效液相色谱仪配紫外检测器检测，测定条件为：Symmetry C18（4.6 mm×150 mm）色谱柱，柱温30 ℃，进样体积20 μL，恒定流速为0.8 μL/min，流动相为甲醇与1‰冰乙酸35 ∶65 的比例，于270 nm 波长下检测，SMX 出峰时间在4.9 min左右。

基于Illumina 高通量测序技术对土壤样品的16S rRNA 基因V4－V5 区进行微生物群落分析：采用Omega 公司的E.Z.N.A. Soil DNA Kit 试剂盒按说明书提取DNA，使用荧光分光光度计检测DNA 浓度和质量，调整DNA 溶液浓度；参考Su 等的方法选取引物及PCR 扩增［15］。PCR 扩增产物通过1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，并使用Axygen 公司凝胶试剂盒回收，回收产物用Microplate Reader（BioTek，FLx800）定量仪器进行荧光定量。最后采用Illumina TruSeq DNA 文库制备实验流程构建上机测序文库。

3 结果与讨论

3.1 粗、细河沙填料模拟柱运行结果对比（相同材质不同粒径）

粗河沙（粒径0.3～1.0 mm）和细河沙（粒径小于0.3 mm）模拟柱运行各阶段的去除效果见图2a。运行期间，去除率在23.2%～51.6%之间波动。随着运行时间的增加，去除率呈逐步降低的趋势。细河沙模拟柱填料粒径更小，污染物与填料的接触表面积更大，初期吸附性能略好于粗河沙（见图2b），但从整体运行效率来看，小粒径带来的初期吸附性能强化，对系统整体去除率并没有显著正效应，反而是粗河沙模拟柱中微生物作用更强（见图2c），使得系统整体去除效率更高。这与粗河沙大粒径导致的系统孔隙率（粗河沙孔隙率19%，细河沙孔隙率6%）更高有关。有研究表明，好氧条件更有利于SMX 降解［16］，更大的孔隙率更有利于微生物的附着生长和系统复氧。系统内微生物群落特征测试结果（见3.5）很好地印证了这一观点，尤其是属水平上的优势菌群伯克氏菌属比例（粗河沙21.6%＞细河沙17.8%）与单周期SMX 微生物平均去除量表现出良好的对应关系。

图2 粗、细河沙填料模拟柱性能对比

总的来说，相同材质（河沙）条件下，小于0.3 mm的粒径虽然吸附性能优于0.3～1.0 mm 的粒径范围，但由于孔隙率偏低，不利于CRI 系统内的氧扩散和微生物降解，反而不利于SMX 的综合去除。

3.2 细河沙、蛭石填料模拟柱运行结果对比（相同粒径不同材质）

细河沙和蛭石填料模拟柱性能对比见图3。

图3 细河沙和蛭石填料模拟柱性能对比

细河沙和蛭石填料粒径均小于0.3 mm，二者的运行结果如图3a 所示。整体来看，蛭石系统去除效果在前3 个阶段略优于细河沙柱体，这与蛭石吸附性能优于细河沙有关，但随着运行时间的持续，吸附趋于饱和，微生物作用逐渐突显，导致运行后期即阶段4 细河沙柱体去除效果优于蛭石。从微生物对SMX 单周期去除量来看，细河沙明显优于蛭石（见图3c）。考虑到蛭石和细河沙系统孔隙率（蛭石9%、细河沙6%）均处于极低水平，系统复氧困难，不利于微生物降解SMX 的情况，观察填料表面状况（见图4），发现蛭石表面为光滑层状结构，与河沙相比，不利于微生物附着，这可能是导致其微生物作用整体较河沙弱的主要原因。

图4 河沙和蛭石填料SEM 表面结构

总的来说，相同粒径范围不同材质条件下，模拟系统效能受吸附性能和微生物作用的综合影响。当吸附性能差异不大（＜5%）时，长期运行（＞1 年）系统效能将主要受微生物影响，有利于微生物附着生长的填料去除效果更好。

3.3 粗河沙、火山岩填料模拟柱运行结果对比（吸附能力相似，不同粒径）

以粗河沙（粒径0.3～1.0 mm）和火山岩（粒径1.0～2.0 mm）为填料的模拟柱运行情况如图5a所示。火山岩的SMX 去除率在30.2%～51.6%之间，随时间的变化总体趋势仍是逐步降低，但火山岩模拟柱初期吸附性能略好，且微生物作用也较强，导致整体运行情况均优于粗河沙。比较而言，微生物作用的贡献优于吸附，说明粒径更大的火山岩（孔隙率35%）比粗河沙（孔隙率19%）更有利于微生物的附着和降解，与3.1 中粗河沙去除效果优于细河沙的规律一致。对照微生物响应状况，更大孔隙率的火山岩单周期SMX 微生物平均去除量表现更好（见图5c），对应属水平上的优势菌群伯克氏菌属比例也更高（火山岩26.3%＞粗河沙21.6%）。

图5 粗河沙和火山岩填料模拟柱性能对比

总的来说，在填料对SMX 的吸附性能略好的情况下，若填料粒径更大，孔隙率更高，系统的整体表现将更好。

3.4 火山岩、活性炭填料模拟柱运行结果对比（相同粒径，吸附能力差异巨大）

火山岩和活性炭填料模拟柱性能对比见图6。

图6 火山岩和活性炭填料模拟柱性能对比

火山岩和活性炭（粒径均为1.0～2.0 mm）模拟柱运行情况见图6a，二者显示出高达50%左右的去除率差异。活性炭对SMX 的吸附能力显著高于火山岩是其整体去除效果远优于火山岩的主要原因，但另一方面，火山岩虽然孔隙率（35%） 高于活性炭（25%），但其微生物作用效果却不如活性炭，分析认为这是在孔隙率达到一定程度，系统复氧差异不大的情况下，生物作用效率高低就取决于有效微生物丰度。对照微生物群落多样性测试结果，活性炭系统内属水平上的优势菌伯克氏菌属丰度占比更高（活性炭达51.2%，火山岩仅26.3%），证实了上述分析。显然，活性炭的微生物降解效率也高于火山岩，系统整体表现更好。由此认为活性炭可作为改进CRI 系统去除新兴污染物效率的备选填料。

值得注意的是，活性炭对30～140 μg/L 的SMX高达100%的吸附效率，不但没有表现出对附着微生物的显著抑制效应，反而提高了微生物群落中有利于SMX 降解的专性菌的占比，说明了抗生素SMX强烈的定向筛选作用。有学者研究显示，包含SMX在内的20 种药物化合物在0～500 μg/L 浓度水平下，微生物酶活性未受到抗生素抑制［17］，这与本试验中微生物未受抑制的现象相符。

3.5 模拟CRI 系统内微生物群落特征与SMX 去除的关系分析

模拟柱运行后期，对各系统填料表面微生物进行采样并开展Illumina 高通量测序分析。表4 列出了指示微生物多样性的Shannon 指数。可以发现，活性炭填料上的微生物群落多样性显著低于其他模拟柱，这是由于活性炭吸附大量SMX 后对微生物产生强烈的定向筛选作用，导致微生物多样性偏低。而SMX 去除效率相近的填料（如粗河沙和火山岩，细河沙和蛭石）其Shannon 指数也更接近。分析认为这一多样性特征受到系统复氧状况的影响，粗河沙和火山岩系统孔隙率大，复氧能力更强，微生物受到SMX和氧的双重条件定向筛选，导致微生物多样性偏低。

表4 5 个模拟系统中微生物物种丰富度和多样性

图7 对5 个模拟系统在门水平上的微生物群落进行了比较。5 个样品共获得27 个菌门，系统内优势菌群为变形菌门，平均丰度达56.8%，其中，在活性炭中该菌门相对丰度最高（79.0%），其余几种填料中该菌门丰度差异较小（48.0%～57.9%）。变形菌门在去除抗菌和抗炎物质方面有重要的促进作用［18］，在SMX 存在的情况下相对丰度最大，说明它具有耐药性［19］。但值得注意的是，门水平的优势菌群丰度与前述各模拟柱运行后期的单周期生物作用SMX平均去除量并没有很好的对应关系。

图7 各模拟系统微生物群落在门水平上的差异

进一步观察属水平上的优势菌微生物丰度水平，见图8。可以看出，属水平上的优势微生物伯克氏菌属的丰度水平与各填料微生物作用强弱表现出良好的对应关系，说明伯克氏菌属可能是模拟系统内降解SMX 的主要微生物。

图8 各模拟系统微生物群落在属水平上的差异

4 结论

通过不同填料的模拟CRI 系统试验，分析系统中填料粒径、初始SMX 吸附能力的影响及系统内微生物的响应特征，主要得出以下结论：

在1.0 m3/（m2·d）的水力负荷、每周期水力停留时间0.4～2 h 的条件下，粗河沙、细河沙、蛭石和火山岩的模拟CRI 系统对SMX 的总体平均去除率为23.2%～51.6%，随时间呈显著下降的趋势，1 年后去除率仅为初始阶段的50%左右。

在30～140 μg/L 的SMX 进水浓度下，活性炭持续表现出高于92.5%的SMX 平均去除率；系统微生物多样性测定表明，伯克氏菌属丰度占比高达51.2%，表现出显著的微生物定向筛选作用。活性炭可作为改进CRI 系统去除新兴污染物效率的备选填料。

在0.3～2.0 mm 的粒径范围吸附量差异不大的填料，装填孔隙率偏大更有利于微生物对SMX 的去除，对应表现出优势微生物伯克氏菌属的丰度更高。

值得注意的是，经过约1 年的SMX 定向筛选作用，各模拟柱运行后期的SMX 生物降解量，与各填料上附着微生物在门水平上的优势菌群丰度并没有很好的对应关系，却与属水平上的优势微生物伯克氏菌属的丰度水平有着良好的对应关系，该现象可为利用属水平的优势微生物丰度指示系统微生物作用强弱提供参考。